25- آنزيمها ي مورد استفاده درمهندسي ژنتيك

 

آنزيم هاابزار كار مهندسي ژنتيك در آزمايشگاه ميباشند و مخقق بدون آنها نميتواند كاري انجام دهد. در اين درس با انواع آنزيمها و طرز كار آنها آشناشده و مورد استفاده هر كدام را بررسي ميكنيم.

الف )  ليگازها :

اين آنزيمها اتصال فسفو دي استر بين تك رشته ها را روي رشته  DNA  تك رشته اي بر قرار ميكند. 5`-p  يك رشته به 3`-OH   رشته ديگر متصل  ميشود.. كو فاكتور آنها ATP يا NAD است .

1-  آنزيم  DNA ligase : اين آنزيم  از باكتري E.coli   استخراج مي شود وكوفاكتور آن NAD است و اكثرا" اتصال  بين دو DNA كه  برش انتهايي ا نها بصورت  Cohesive  باشد  را بر قرار ميكند و عده اي معتقدند كه اين آنزيم در فر قرار كردن اتصال بين دو  DNA  كه  برش انتهايي آنها بصورت blunt   باشد مشكل خواهد داشت .

 2- آنزيم  T4 DNA ligase : اين آنزيم از فاژ T4  استخراج ميشود وكوفاكتور آن ATP است . اين آنزيم  اتصال هر دو انتهاي Cohesive  و blunt  را بر قرارميكند.

 3- آنزيم  T4 RNA ligase : اين آنزيم اتصال فسفو دي استربين 3`- OH  و  5`-P  مولكولهاي RNA  را بر قرار ميكند . كوفاكتور آن ATP و Mg2+ است

ب)  نوكلئاز ها :

اين آنزيم ها  نوكلئو تيد هار ا تجزيه ميكنند.

4- آنزيم  DNase I  : يك اندو نوكلئاز است و dsDNA را به روش غير اختصاصي تجزيه ميكند . كوفاكتور آن  Mg2+ ، ⁺  Ca2  و Mn2⁺  است .. اين آنزيم براي مقا صد زير استفاده ميشود:

- تجزيه غير اختصاصي DNA 

-  نشاندار كردن DNA

- ايجاد موتاسيون در ژن

5-   نوكلئاز استافيلوكوكي : DNA  و RNA  را به روش غير اختصاصي تجزيه ميكند.

6- انزيم   RNase A-  اين آنزيم RNA  تك رشته اي را هيدروليز ميكند.

 7- آنزيم RNase H - اين آنزيم RNA  را كه با DNA دوبلكس  شده باشد  راهيدروليزميكند و در سنتز   رشته  دوم cDNA  كاربرد دارد.

8-  آنزيم  S1 Nuclease  : اين آنزيم پلي نوكلئو تيد تك رشته اي را هيدروليز ميكند.

 

 

9- آنزيم  Mong bean Nuclease – اين آنزيم شبيه  S1 Nuclease  عمل ميكند

10- آنزيم  Exonuclease III    (گزو نوكلئاز :  (3`→ 5   فعاليت 3`  فسفاتاز دارد

همچنين فعاليت شبيه RNase H  هم دارددارد.

اين آنزيم اتصال فسفودي استرجايگاههاي آپوريني يا آپيريميديني را تجزيه ميكند

11- آنزيم  Bal1 Nuclease : اين آنزيم ssDNA  را به روش اگزو نوكلئازي يا اندو نوكلئازي تجزيه ميكند

ج ) آنزيم هاي محدود گر

د)  متيلازها

12-  فسفاتازها :  اين آنزيمها فسفومونواسترازغيراختصاصي هستندكه درpH قليايي فعاليت ميكنند و درحضور پذيرنده هاي فسفات مانند اتانل آمين و Tris  بعنوان فسفو ترانسفراز عمل ميكتتد .

فسفاتاز اتصال P--O را تجزيه ميكند ولي فسفوريلاز اتصال C--O را تجزيه ميكند

كاربرد فسفاتاز ها :

دفسفريلاسيون انتهاي فسفات اسيد نوكلئيك 

وقتي با پروتئين يا اسيد نوكلئيك كنژوگه شوند بعنوان آنزيم رپورتر عمل  ميكند

 بعنوان leader  در ترشح خارج سلولي و پروتئين هاي فيوژن عمل ميكند

13-  آنزيمهاي T4 poly Nucleotid Kinase    : اين آنزيمها فسفات γ را از NTP به مولكول پذيرنده (Aceptor)  انتقال ميدهد و عبا رتند از:

پروتئين كيناز ها

 كربو هيدرات كينازها

پلي نوكلئو تيد كينازها

آنزيم T4 poly nuleotide kinase براي فسفريله كردن يا نشاندار كردن 5`- OH استفاده ميشود ، همچنين براي اندازه گيري فعاليت اندونوكلئازي بكار ميرود.

ه ) DNA پليمرازها : گروهي از آنزيمها هستند  هستند كه بكمك چهار نوكلئوتيد تري فسفات  (dNTP) از روي رشته الگو يك رشته DNA  سنتز ميكنند.  اين آنزيمها براي فعاليت خود احتياج به پرايمر دارند. چنانچه داراي فعاليت   3→ 5`` اگزونوكلئازي  باشند كار  غلط گيري ( proof reading )   را هم انجام ميدهند

14- آنزيم DNA polymerase I  :

  اين آنزيم داراي فعاليت هاي زير است :

 فعاليت 3→ 5``   اگرونوكلئازي

فعاليت  5`→ 3`   DNA پليمرازي

فعاليت RNase H

فعاليت نوكلئازي

اين آنزيم براي كارهاي زير استفاده ميشود :

DNA LabelingNick  translation

ايجاد انتهاهاي Blunt

15- آنزيم T4 DNA plymerase: يك آنزيم مولتي فانكشنال است وبراي كارهاي زيراستفاده ميشود.

 داراي فعاليت DNA  پليمرازل

 فعاليت  3→ 5``   اگرونوكلئازي

براي PCR   هم قابل استفاده است و در 37 درجه فعاليت ميكند

براي ايجاد انتهاهاي Blunt  در dsDNA  استفاده ميشود

فعاليت 5`    نوكلئازي ندارد

16- آنزيم T7 DNA plymerase: اين آنزيم داراي  فعاليت 3→ 5``   اگرونوكلئازي ميباشد

Sequenase نسخه اي از اين آنزيم است كه فاقد فعاليت 3→ 5``   اگرونوكلئازي ميباشد وبراي Sequencing استفاده ميشود

سرعت پليمريزاسيون اين آنزيم زياد است و براي سنتز رشته موتاژن در موتاژنزيس بكار ميرود

انتهاي 5`overhang را پر ميكند

17-  آنزيم Taq DNA polymerase  : اين آنزيم از باكتري گرمادوست ترموس اكواتيكوس استخراج ميشود

 فعاليت 3→ 5 اگزو نوكلئازي ندارد

فعاليت 5`  نوكلئازي دارد

فعاليت ترمينال ترانسفرازي دارد

آنزيمهاي  نسخه بردار معكوس () :  گروهي از DNA polymerase  ها بنام    RNA - dependent DNA polymerase يا Reverse Transcriptase گفته ميشوند  اين آنزيمها  RNA  را الگو قرار داده و  DNA  مكمل آن را سنتز ميكند و عبارتند از:

  18 - آنزيمAvian Myeloblastosis Virus ) AMV)  : اين آنزيم از نوعي ويروس استخراج ميشود كه در پرندگان بيماري ايجاد ميكند .

 اين آنزيم فعاليت RNase H  هم دارد و براي سنتز رشته دوم cDNA  استفاده ميشود

19- آنزيم  Molony Murine Leukemia Virus ) MLMV)  : اين آنزيم از نوعي ويروس استخراج ميشود كه در جوندگان بيماري ايجاد ميكند.

آين آنزيم   فعاليت RNase H   كمتري  از آنزيم AMV دارد .

 

20 – آنزيم  ترمينال ترانسفراز :

 اين آنزيم پليمريزاسيون dNTP هارا ازروي پايه  3`- OH انجام ميدهد . اين آنزيم براي اتصال نوكلئوتيد ها به انتهاي 3`- OH رشته DNA استفاده ميشود وبراي كلونينگ محصول PCR قابل استفاده است.

21- آ نزيم هاي RNA polymerase    :

اين آنزيم ها اطلاعات ژنتيكي را از DNA  به RNA  منتقل ميكنندو عبارتند از

RNA  پليمراز باكتريايي

T7 RNA  پليمراز  ، يك پروموتور قوي دارد

T3 RNA  پليمراز

 SP6 RNA  پليمراز

 22- آنزيم پليمراز A: :

اين آنزيم دم پلي A  را سنتز ميكند ودر انتهاي3`  رشته  mRNA  سلولهاي يوكاريوت غير هيستوني يافت ميشود.

اين آنزيم ميتواند RNA هاي polyA   منفي را به polyA⁺  تبديل كندو آنها را بكمك  oligo) dT) بعنوان پرايمر، به cDNA  تبديل نمايد

23-  آنزيم هاي رپورتر / ماركر:

 ابن آنزيمها در كلونينگ استفاده ميشوند وچون سريعا" بيان ميشوند براي غربالگري كلني هاي باكتريايي مفيد ميباشند (  آنزيم بتا گالاكتوزيد ازبراي غربالگري  توضيح داده ميشود)

ß گالاكتوزيداز - اتصالات گالاكتوزيدي را در اليگو ساكاريد ها هيدروليز ميكند

ß لاكتاماز - اتصالات آميدي را در حلقه ß لاكتام هيدروليز ميكند و پني سيلينوئيك اسيد  و سفالوسپوروئيك اسيد توليد ميكنند كه از نظر بيولوژيك غير فعال هستند

-كلرامفنيكل استيل ترانسفراز ( CAT) - كلرامفيكل را غير فعال ميكنند

-لوسيفرازها - آنزيم هاي توليد كننده نور هستند.

 

 

آنزيم هاي ( برش دهنده) محدود گر  ((Restriction Enzymes

 

اندو نوكلئازهاي محدود كننده گروهي از DNase  ها ميباشند كه توالي نوكلئو تيدي خاصي را شناسايي ميكنند . اين آنزيم ها  dsDNA  را بصورت اختصاصي يا غير اختصاصي برش ميدهند.  اين آنزيم ها اولين بار در دهه 1950 به عنوان سيستم هاي Resriction وModification  ( باكتريها براي جلوگيري از حمله باكتريوفاژها و عناصر ژنتيك خارجي اين سيستم ها را بكار مي برند ) كشف شدند. باكتريها توسط سيستم R-M ميتوانند DNA اي را كه از خارج  هنگام عفونت ،كنژو گاسيون و ترانسفكشن وارد آنها ميشود را تخريب كنند.سيستم R - M  باكتريايي  معادل  سيستم ايمني   پروكاريوتي   ميباشد.

سيستم هاي R-M كه در ميكرو ارگانيسمها ( باكتريها ) يافت ميشوند بسيار گوناگون  ميباشند (حتي در داخل يك سلول ) . تعداد اين آنزيمها از 2100 فراتر رفته و 17 آنزيم نوع I ، 179  آنزيم نوع II و 4 آنزيم از نوع III وهمچنين مشخصات 190 متيل ترانسفراز تغيير دهند DNA تعيين و شناسايي شده است .

سيستم هايR-M   دو فعاليت آنزيمي دارند:

الف ) يك اندونوكلئاز  (R.ENase) با جايگاه اختصاصي كه مسئول هضم DNA خارجي ميباشد

ب) يك متيلاز تغيير دهنده DNA ( متيل ترانسفراز ) كه همان توالي ويژه را شناسايي ميكند .  متيل ترانسفراز ( M.MTase) مسئول تغيير دادن وحفظDNA  خودي  از هضم شدن توسط  R.ENase ميباشد. ممكن است فعاليت  R وM در يك آنزيم (واحد) كه داراي چند زير واحد است قرار داشته  و يا از نظر فيزيكي آنزيم هاي جداگانه  باشند. علي رغم اينكه آنزيم هاي Restriction   و   Cognate Modifications  سكانس مشابه را شناسايي ميكنند، ترادف اسيد آمينه آنها يكسان نيست، شايد اين آنزيم ها با مكانيسم متفاوت DNA  هدف را شناسايي ميكنند .

 

انواع سيستم هاي آنزيمي  Restriction - Modification

بر اساس تركيب آنزيم ، كوفاكتورهاي مورد نياز ، قرينگي توالي DNA  اي كه شناسايي ميكنند و مشخصات هضم DNA   به چهار نوع تقسيم ميشوند. لازم به ذكر است كه گروه متيل دهنده  سوبسترا در تمام متيل ترانسفرازها AdoMet ميباشد.

آنزيم هاي  R-M نوع   I:

 مجموعه چند آنزيمي متشكل از زير واحد هاي غير همسان بنام  R,M و S ميباشند. زير واحد S اختصاصيت را براي MوR تعيين ميكند. كوفاكتور هاي اين آنزيمها  ATP وMg2+   ميباشند و DNA  اي كه تغييري  در آن ايجاد نشده باشد را در محلي دور از جايگاه شناسايي و تا اندازه اي بصورت احتمالي ( Random ) برش ميدهند . هيدرو ليز ATP قسمتي از فعاليت Restriction   اين آنزيم ها ميباشد  و بطريق رقابتي با فعاليت اندون.كلئازي    خودش جايگاه اختصاصي DNA   هدف را متيله ميكنند.

آنزيم هاي R-m  نوع II  :

اين آنزيمها داراي   فعاليت  R.ENase  و M.MTase  جداگانه ميباشند . R.ENase  ها دايمر بوده و زير واحد هاي آنها همسان است در صورتيكه M.MTase  ها آنزيم هاي مونومر ميباشند . R.ENase  هاي نوع II براي فعاليت خود فقط  Mg2⁺  نياز دارند.

R.ENase  ها و M.MTase  ها تواليهاي  اختصاصي نوكلئوتيدي مشابه را شناسايي ميكنند . اكثر R.ENase  هاي نوع دوم  DNA  را ازمحل جايگاه شناسايي برش ميدهند ولي  تعدادكمي از آنها كه نوع IIS گفته ميشوند DNA  را در فاصله معيني  از جايگاه شناسايي برش ميدهند .

آنزيم هاي R-M نوع III:

 اين آنزيم ها متشكل از دو زير واحد غير همسان ميباشند كه براي فعاليت رستريكشن به   ATPو  Mg2+  نياز دارند. اين آنزيم هاتوالي هاي كوتاه غير پاليندرم را شناسايي كرده و DNA  را از محلهاي معين (درصورتيكه درجايگاه شناسايي  تغييري ايجادنشده باشد )برش ميدهند اين آنزيمها ATP  را هيدروليز نميكنند و براي برش دادن DNA  به AdoMet   ( S-adenosylmethionine)نياز ندارند اما AdoMet  موجب تحريك فعاليت اندو نوكلئازي آنهاميشود.

آنزيم هاي نوع  IV :

اين آنزيمها از نظر تكاملي بين آنزيم هاي نوع  IIوIII ميباشند. اين آنزيمها (مانند Eco571) متشكل از R.ENae  و M.MTase  جدا گانه ميباشند اما R.ENase  كه يك آنزيم مونومر ميباشد  فعاليت متيلازهم  دارد. اين فعاليت متيلازي قدرت كافي ندارد تا DNA  ميزبان را در In vivo محافظت كند.R.ENase  و M.MTase  توالي هاي ناقرينه را شناسايي ميكنند . R.ENase  در حضور Mg2⁺  در فاصله معيني  از جايگاه شناسايي,   DNA  هدف را برش ميدهد ( مثلا" Eco571 بفاصله 14/16 نوكلئو تيد از محل شناسايي اين كار را انجام  ميدهد ) . فعاليت Restriction  آنها توسط AdoMet تحريك ميشود.

 

 

 

سيستم هاي Modification يا Restriction  مستقل

علاوه بر چهار سيستم آنزيمي كه بحث شد ، بعضي از باكتريها سيستم هاي ديگري مانند سيستم R  مستقل از M و سيستم M  مستقل از R  دارند. يك مقوله اي از سيستم هاي R-M  كه در تكنولوژي نو تركيب اهميت بخصوصي  دارد  Restriction  وابسته به Methylation )    MDRS)  ميباشد كه R.ENase   ترجيحا" DNA  را در جايگاههاي متيله برش ميدهد . MDRS  متشكل از فرآورده هاي ژني است كه  به چندين جايگاه مستقل در ژنوم E.coli K12 مانند mcrA , mcrB    و mrr متصل ميباشند.

 

جدول شماره 5- طبقه بندي سيستم هاي R-M

 

 

 

 

سيستم هاي آنزيمي  R-M نوع II:

 آنزيم هاي محدودكننده ،  مخصوصا" نوع II توالي نوكلئو تيدي منحصر بفرد را شناسايي ميكنند. دقت در انتخاب توالي نوكلئو تيدي خاص ، تنوع توا لي  جايگاه شناسايي و آساني نسبي كنترل Restriction  با استفاده از  M.MTase   ، آنزيم هاي نوع II  را وسيله اي ضروري براي  دستكاري DNA  نموده  است . بعلاوه توسعه DNA  نوتركيب نتيجه كشف آنزيم هاي با جايگاه اختصاصي ميباشد.

تا كنون ژن ^{حدودصدسيستم} R-M كلون شده وتعيين مشخصات شده اند.  ژن سيستم هاي R-M از نظر سازمان، Orientation  و اندازه هتروژن هستند . كلونينگ ژنهاي آنها خالص سازي آنزيم را آسان تر كرده  و آنزيم  با خلوص  بالاتر تهيه ميشود . بنا بر اين با قيمت كمتر براي  استفاده  وسيع تر در دسترس  قرار دارند .  اين كشف موجب شد  تا جزئيات مكانيسم واكنش و بر خورد  DNA -protein   در سطح مولكولي مطالعه شود. اغلب R.ENase  ها بصورت تجارتي در دسترس قرار دارند و براي ايجاد قطعات DNA براي كلون كردن ژن ، تعيين نقشه DNA  و كروموزوم ، DNA Sequencing   و هيبريداسيون بطور گسترده استفاده ميشودارند.

 

نامگذاري آنزيمهاي R-M

1-   سه حرف  اول ( ايتاليك ) جنس ( اولين حرف جنس باكتري ) و گونه ( دومين و سومين حرف )  ارگانيسم منبع را بيان ميكند.  مانند Eco براي E.coli  و Hin  براي هموفيلوس آنفلوآنزا .

2- بعد از  سه حرف مذكور حرف اول  سويه يا گونه  بصورت  غير ايتاليك و يا اعداد عربي مي آيد مانند:  EcoK بري Ecoli   سويه K  ،   Hind  براي H.influenza   سويه d  يا Sau 3A  براي استافيلوكوك اورئوس 3A  . عناصر خارج كروموزومي مانند ويروس يا پلاسميد به همين صورت  متعاقب اسم مذكور آورده ميشود مانند: EcoRI و EcoPI.

3-  متعاقب آن بدون در نظر گرفتن فاصله ، اعداد روماني (I,II,III,.....) براي تعيين آنزيم هاي مختلف كه توسط همان سويه توليد ميشوند مانند HindII و HindIII .

4-  براي اختصاصي كردن R.ENase  يا M.MTase  حروف بزرگ R و M در جلو نشانه آنزيم قرار ميگيرد و با يك نقطه از آن فاصله  ميگيرد مانند : R.EcoRI  و M.EcoRI.

 

 

 

 

جدول شماره 6- كد اسيد هاي نوكلئيك  جايگاه شناسايي آنزيم ها ي محدود گر