استراتژي " فرآيند عمليات پايين دستي " در تعيين سرنوشت محصول نهايي از اهميت زيادي برخوردار است. امروزه به دليل وجود روشهاي جداسازي متعدد, طراحي " فرآيند عمليات پايين دستي " از انعطاف پذيری زيادي برخوردار شده است. به همين دليل امکان استفاده از استراتژی هاي متفاوت برای دستيابي به محصول مورد نظر وجود دارد.

هدف اين فصل آشنا نمودن کارآموزان با ويژگي هاي مهم يک " فرآيند عمليات پايين دستي " بهينه و نحوه سازماندهي عملياتي دستيابي به آن است. در اين فصل ابتدا خصوصيات يک " فرآيند عمليات پايين دستي " بهينه و مطلوب تشريح خواهند شد. سپس فازهای عملياتي در قالب فازهای تحقيق و توسعه برای دستيابي به استراتژي بهينه
" فرآيند عمليات پايين دستي " شرح داده مي شوند. در نهايت به حوزه عملکرد و وظائف اين فازهاي عملياتي پرداخته خواهد شد.

در پايان اين فصل انتظار مي رود تا کارآموزان قادر به پاسخ دادن به سئوالات زير باشند:

ويژگي هاي مهم يک " فرآيند عمليات پايين دستي " بهينه کدامند؟

ويژگي هاي طراحي " فرآيند عمليات پايين دستي " براي دستيابي به کيفيت بالا در محصول نهايي کدامند؟

چرا بررسي هاي اوليه از نياز و حجم بازار مصرف در طراحي " فرآيند عمليات پايين دستي " از اهميت برخوردار است؟

براي پايين آوردن هزينه هاي يک فرايند چه ملاحظاتي را بايد در نظر گرفت؟

راه هاي ممکن براي دستيابي به روش مشخص در طراحي " فرآيند عمليات پايين دستي " کدامند؟

طراحی " فرآيند عمليات پايين دستي " در دو فاز تحقيق و توسعه چگونه انجام مي گيرد؟

ويژگي هاي يک " فرآيند عمليات پايين دستي " بهينه

قبل از شروع " فرآيند عمليات پايين دستي" برای جداسازي يك محصول خاص لازم است تمامي تلاشها درجهت ايجاد يك فرآيند عملياتي بهينه انجام پذيرد. سه ويژگي مهم يك " فرآيند عمليات پايين دستي" بهينه عبارتند از : ورود به بازار در اولين زمان ممكن, كيفيت بالا, و نهايتاً هزينه پائين. طراحي تمامي فرايندهاي تخليص بايد براساس اين سه ويژگي صورت پذيرد تا قادر به ارائه پايدار و ثابت محصول مورد نظر درميدان رقابت با ساير فرايندهاي طراحي شده باشد.

ورود به بازار در اولين زمان ممكن

طراحي " فرآيند عمليات پايين دستي" بايد به نحوي انجام شود كه اولاً حداقل زمان ممكن براي انجام اين عمليات و توليد فراوردة مورد نظر صرف شده و ثانياً فرايند به صورتي كامل و داراي كمترين امكان تغيير بعدي موفق به اخذ گواهي نامه گردد . درصورتيكه " فرآيند عمليات پايين دستي" به صورت ناقص يا با تغييرات مداوم مواجه گردد، بدون شك اخذ گواهي نامه براي آن مشكل بوده و درصورت اخذ، ايجاد تغييرات بعدي نياز به تأييد مجدد دارد كه مي تواند سبب صرف هزينه هاي گزاف گردد. درعين حال استفاده از حق انحصاري توليد (Patent) يا بدست آوردن بازار مصرف بيشتر درميدان رقابت با ساير توليد كننده ها از جمله مواردي است كه مي تواند نتيجه طراحي فرآيندي با حداقل زمان ممكن و پايدار باشد.

كيفيت بالا

هميشه ورود به بازار در اولين زمان ممكن و دستيابي به حق انحصاري توليد به عنوان مهمترين پارامتر تعيين كننده براي بهترين طراحي " فرآيند عمليات پايين دستي" به شمار نمي رود. به خصوص مواقعي که محصول مورد نظر منحصر به فرد نبوده و امکان توليد آن به صورتهاي مختلف وجود داشته باشد, برخورداري محصول از كيفيتي بالا، عامل مهم و بسيار مؤثر در عرصه رقابت با ساير توليدكننده هاي همان محصول به شمار مي رود.

به هر حال شناخت يك محصول با كيفيت بالا بحث بسيار مفصلي است كه در اينجا به مهمترين وجوه آن خواهيم پرداخت. بديهي است شناخت دقيق تر مسئله كيفيت مي تواند در بحث هاي اختصاصي كنترل كيفي محصولات بيوتكنولوژيك حاصل گردد.

در طراحي فرايند " فرآيند عمليات پايين دستي" توليد و پالايش براي حصول به كيفيت بالا در محصول نهايي بايد نحوة دستيابي به ويژگي هاي ذيل در طراحي " فرآيند عمليات پايين دستي" در نظر گرفته شود.

درجة خلوص بالا

با توجه به اينكه هدف اصلي در فرآيند پالايش ، جداساختن محصول پروتئيني مورد نظر از ناخالصي ها است، بديهي است كه دستيابي به درجه خلوص بالا از اهميت زيادي برخوردار است. اما مفهوم خلوص از دو ديدگاه مطرح
مي گردد: خلوص عملكردي (functional purity) و خلوص شيميايي (chemical purity). بالا بودن خلوص محصول از نقطه نظر عملكردي به بالابودن قدرت اثر (potency)، بالا بودن نيمه عمر (Half life)، بالا بودن پايداري (stability) و حداقل وجود اثرات جانبي محصول تعبير مي شود. درحاليكه درخلوص شيميايي ميزان همگوني (Homogeneity )، ميزان ناخالصي ها و آلاينده ها، مقدار افزودني هاي مجاز و ميزان يكسان بودن (identity) مورد توجه است. جهت بررسي بيشتر هركدام از پارامترهاي فوق به منابع كنترل كيفي مراجعه نماييد.

درجة خلوص مورد نياز براي محصول نهايي كاملاً با كاربرد و ميزان استفاده آنها مرتبط است. بطور مثال درجة خلوص مورد نياز براي محصولاتي كه مصارف تشخيصي و in vitro دارند پائين تر از محصولاتي است كه براي درمان استفاده شده وبه صورت in vivo مصرف مي شوند . همچنين درمحصولاتي كه در انسان مصرف مي شوند درجه خلوص با افزايش مقدار مصرف در طول عمر افزايش مي يابند؛ به طوريكه درجه خلوص مورد نياز براي واكسنها در مقايسه با دارويي تزريقي نظير انسولين كمتر است. در نمودار 1-1 ميزان خلوص مورد نياز برخي ازانواع محصولات بيوتكنولوژي و در مقايسه با ميزان مصرف آنها در طول عمر مقايسه شده است.

نمودار 1-1- مقايسه درصد خلوص مورد نياز محصولات مختلف بيوتکنولوژي. با توجه به مورد مصرف و مقدار مصرف محصولات بيوتکنولوژی درجة خلوص مورد نظر تغييرمي کند.

EPO: Erythropoetin/
hGH: Human Growth Hormone/
SOD:Super Oxidase Dismutase

فعاليت بالا

هر پروتئين به عنوان يك محصول بيولوژيك به منظوري خاص توليد و تخليص مي گردد. برخي
آنتي ژنهايي هستند كه جهت استفاده در كيتهاي تشخيصي توليد مي شوند و لذا فعاليت ايمونولوژيك آنها درصورت استفاده از روشهايي نظير (Enzyme Linked Immonosorbent Assay ) ELISA در برخورد با
آنتي بادي مهم است. برخي ديگر به عنوان يك آنزيم بايد داراي فعاليت خاص آنزيمي باشند. همچنين محصولاتي نظير واكسنها يا محصولات دارويي نيز هركدام به نوبة خود داراي تعاريفي خاص از فعاليت مي باشند كه بعضاً از طريق روشهاي مرسوم Activity test ( به عنوان مثال در مورد پروتئين استرپتوكيناز Streptokinase روش تست Calorimetric خاص وجود دارد ) فعاليت آنها مشخص مي گردد. بنابراين برحسب ملاحظات مربوط به فعاليت هرمحصول پروتئين مشخص بايد محصول مورد نظر داراي فعاليت بالا بوده و در مقايسه با مراجع ملي يا درصورت لزوم بين المللي مورد قبول باشند تا يكي از ويژگي هاي كيفيت برآورده گردد .

ثبات بالاي فرايند طراحي شده از يك بچ به بچ ديگر

اين ويژگي يكي از اساسي ترين مسائل طراحي يك فرايند تخليص مي باشد و به نحوي مشخص ثبات فرايند را از نظر بكارگيري مقدار يكسان از مواد اوليه، توليد يكسان محصول و تكرارپذيري هرفرايند و عدم ايجاد تغييرات محسوس در روشها از هر بچ به بچ ديگر را دربر مي گيرد.

درعين حال دركنار اين ويژگي نبايد فراموش كرد كه اين مسئله هيچ منافاتي با مسئله انعطاف پذيري يك فرايند درمراحل تحقيق و توسعه و انعطاف پذيري در شكل و تركيب محصول توليد شده ندارد. منظور اين است كه از يك طرف در مراحل تحقيقاتي بايد از روشهايي براي خلوص استفاده گردد كه درصورت برخورد با هرمشكلي در مراحل صنعتي كردن (Scale up) به توان آن را با روشهاي ديگر جايگزين نمود. از طرف ديگر محصولات بيوتكنولوژي مي توانند به صورتها و شكلهاي گوناگون به بازار مصرف عرضه گردند، لذا انعطاف پذيري فرايند درجهت توليد اشكال متفاوت يك محصول ( مثلاً محلول يا ليوفيليز شده، ... ) مي تواند از ويژگي هاي ممتاز يك فرايند باشد .

هزينة پائين

درصورتيكه محصول به عنوان يگانه محصول موجود نبوده و كيفيت محصول تمام رقابت كننده ها از سطح يكساني برخوردار باشد، مسئله قيمت و هزينه توليد به عنوان پارامتري مهم و در درجة اول اهميت مطرح مي گردد. اين درحالي است كه نياز بازار نيز مي تواند بر مسئله هزينة فرايند توليد در واحد گرم محصول پروتئيني تأثير عمده اي داشته باشد. براي مثال در مورد محصولات پروتئيني نظير آلبومين نوتركيب و هموگلوبين نوتركيب كه داراي ميزان مصرف چندين گرم هستند و ساليانه مقادير بسيار زيادي از آنها مورد نياز است، بهينه كردن هزينة اقتصادي فرايند توليدي بسيار حائز اهميت بوده و در مقايسه با محصولات نوتركيب معمولي هزينه هاي اقتصادي بايد 1 تا 2 برابر كاهش داشته باشد. ازطرف ديگر، مسئله اي كه مي تواند بر روي هزينة پائين يك فرايند تأثير داشته باشد، طراحي اولية صحيح و اصولي آن است تا اينكه امكان تغييرات بعدي در طراحي را, كه بسيار پرهزينه است، از بين برده و در مجموع هزينة فرايند کاهش بيايد.

به هرحال عواملي نظير اندازة بچ توليدي، مقياس توليد، نيروي كار, و اتوماسيون بر هزينة اقتصادي كلي يك فرايند تأثير گذاشته و به صورت عواملي مرتبط با يكديگر امكان موازنة اقتصادي هزينه ها را فراهم مي آورند.

به عنوان نمونه، درصورتي كه فرايند داراي سطح اتوماسيون ( كنترل فرايند از طريق سيستم هاي كامپيوتري و الكترونيكي ) بالايي باشد، هزينة كارگر مي تواند به نحو چشمگيري كاهش يابد. در اين صورت امكان كاهش اندازة بچ توليدي و تقسيم فرايند به چندين فرايند با استفاده از دستگاه هاي كوچكتر امكان پذير بوده و هزينه هاي سرمايه گذاري را كاهش داده و متعاقباً هزينة مربوط به فضا و محيط كار نيز كاهش خواهد يافت. اگر امكان كنترل فرايند از طريق سيستم هاي اتوماسيون موجود نباشد، بزرگ كردن اندازة بچ توليدي مي تواند هزينه هاي كارگر را درمجموع كاهش داده و به نفع كاهش سرمايه گذاري عمل كند.

در ادامه طراحي يك فرايند ساده با بهره گيري از كمترين مراحل تخليص مي تواند كمك مؤثري درجهت كاهش همة هزينه ها را داشته باشد.

نقطه شروع

براي شروع طراحي يك فرايند ابتدا لازم است مراحل مقدماتي و اوليه طي شود . بدين ترتيب كه درمرحلة اول لازم است كه نياز بازار براي محصول مورد نياز شناخته شود و در واقع حجم كاري مورد نياز جهت توليد يك محصول پروتئيني دقيقاً مشخص گردد. آنگاه مقياس صنعتي مورد نظر جهت توليد محصول مورد نظر شاخته شده و در اين مرحله براساس اين اطلاعات تکنيک هاي مقياس پذير و مقرون به صرفه شناسايي شده تا اينكه حتي الامكان از اين تكنيكها در فرايند طراحي استفاده شود و از ايجاد تغييرات بيشمار در عمل Scale up نهايي ممانعت مي شود. سپس بعد از شناخت اين تكنيكها با كوچك كردن مقياس صنعتي به مقياس تحقيقاتي و آزمايشگاه (Scale down) ، حجم كار در مقياس آزمايشگاهي شناخته شده تا اينكه طراحي فرايند دقيقاً براساس اين حجم انجام گردد. استراتژي كاري فوق در مراحلي كه در چارت (1-1) هم نشان داده شده است، داراي اين مزيت مي باشد كه طراحي يك فرايند دقيقاً درجهت توليد و اجراي يك فرايند توليدي از همان نقاط شروع و انجام پذيرفته و از طراحي فرايندهاي بي ثبات و متغير كه هيچ هدفي جزء كاركرد اوليه درهمان سطح آزمايشگاهي ندارند، احتراز مي گردد.

چارت 1-1- مراحل مقدماتي براي شروع طراحي يک فرايند با هدف توليد محصول متناسب با حجم و نياز بازار مصرف

درمرحلة طراحي " فرآيند عمليات پايين دستي" آنچه كه پس از گذر از مراحل اوليه و مقدماتي فوق مسئله را دشوار و پيچيده مي كند, وجود تعداد بيشماري از روشهاي جداسازي و كروماتوگرافي و تفاوت مواد اوليه و خام جهت انجام جداسازي است. سئوال اساسي در اينجا اين است كه آيا يك روش مشخص براي طراحي " فرآيند عمليات پايين دستي" وجود دارد؟ پاسخ منطقي به اين سؤال استفاده از تجريبات ديگران است كه به سه صورت زير مي تواند جلوه گر شود :

الف ) استفاده از روشهاي جداسازي موجود و كپي كردن آنها با توجه به شناخت ويژگي هاي مواد اوليه محتوي محصول پروتئيني مورد نظر. با توجه به اينكه روشهاي كروماتوگرافي مختلفي وجود دارد كه بعضاً براساس ويژگي هاي كلي مواد نظير قدرت يوني ، ميزان آبگريزي و يا ميزان نفوذپذيري كار مي كنند و برخي از روشها نيز بصورت خاص و ويژه خواص بيولوژيك عمل مي كنند، لذا مي توان انجام يك فرايند جداسازي را از يك محصول به محصول ديگر با رعايت برخي تغييرات تعميم داد. بديهي است بايد ساده ترين روشها را انتخاب كرد و بدين ترتيب در هزينه هاي طراحي و زمان صرفه جويي مي گردد.

ب ) به هرحال دربرخي موارد مي توان با توجه به ميزان شناخت از محصول پروتئيني، روشهايي ابتكاري را براي جداسازي به كار گرفت. در بعضي موارد اين روشهاي ابتكاري نتيجه كار گروهي در دو بخش" فرآيند عمليات بالا دستي" و " فرآيند عمليات پايين دستي" است؛ مي توان از طريق دانش بيولوژي مولكولي و مهندسي ژنتيك تغييرات خاصي در ساختار پروتئين مورد نظر ايجاد كرد و روشهاي تخليص را به صورت ويژه در مورد آن محصول بكار برد. به عنوان مثال امروزه استفاده از فيوژن پروتئين ها كه مثلاً داراي گروه هاي هيستيدين بوده و به راحتي مي توانند توسط روشهاي خاص Affinity chromatography جداسازي شوند, بسيار مرسوم است ( اين بحث بصورت اختصاصي در فصول بعد مطرح خواهد شد ) .

ج ) روش سومي كه بازهم ريشه در تجربيات ديگران دارد استفاده از سيستم هاي ماهر هوشمند است. امروزه نرم افزارهاي كامپيوتري وجود دارند كه مي توانند محتوي روشهاي مختلف جداسازي براساس ويژگي هاي محصولات مختلف پروتئيني باشند.

به هرحال ممكن است طراحي فرايند تركيبي از هرسه روش فوق با پيش زمينة استفاده از تجربيات ديگران باشد.

مراحل توسعة " فرآيند عمليات پايين دستي"

توسعة " فرآيند عمليات پايين دستي" به فازهاي مختلفي مي تواند تقسيم بندي شود كه هركدام از اين تقسيم بندي ها براساس مسئوليت ها و نيازهاي مستند سازي (Documentation) و تضمين كيفيت (Quality Assurance) انجام مي پذيرد. اساسي ترين تقسيم بندي توسعة " فرآيند عمليات پايين دستي" را به فازهاي تحقيق (Research), توسعة (Development), و توليد (Production) با وظايف و ويژگيهاي متفاوت تقسيم مي نمايد. در فاز تحقيقاتي مسئله اصلي ارائه يك طرح اوليه تخليص با توجه به نيازها واهداف توليد محصول است. در فاز توسعه, طرح اوليه ارائه شده توسط متخصصين فاز تحقيق، مورد بررسي قرار مي گيرد تا اينكه يك فرايند توليدي كه يك محصول را با كيفيت ثابت, قابل اطمينان، ايمن,و مؤثر بوجود آورد طراحي شده و بتواند بصورت مستند نيازها و ويژگي هاي لازم براي تأييد هاي قانوني را برآورده سازد. نهايتا" فاز توليد, وظيفه توليد محصول مورد نظر را با توجه به نياز بازار مصرف در يک مقياس صنعتي به عهده دارد.

متخصصين هر سه فاز تحقيق, توسعه, و توليد در يک کار گروهي مشترک مسئله توسعة " فرآيند عمليات پايين دستي" را با توجه به آنچه در بحث نقطة شروع مطرح شد, مورد بررسي قرار مي دهند. همچنين پس از تحقق اهداف از پيش تعيين شدة هر فاز, لازم است که همکاري طي يک سازمان دهي خوب ودقيق, و براي ايجاد ارتباط بين فازها و انتقال کامل اطلاعات و داده ها انجام پذيرد.

ويژگي ها و الزامات فاز تحقيق

1 ) ارائه روشها و تكنيكهاي مورد نياز جهت تخليص پروتئين مورد نظر حتي الامكان به صورت يك طرح كلي فرايند تخليص .

2 ) در فاز تحقيق امكان تعيين پارامترهاي حساس و مراحل بحراني طرح فرآيند پالايش و نيز شرايط قابل قبول و آزمايشهاي لازم براي آزمون هرمرحله وجود دارد. اين اطلاعات كمك قابل توجهي به متخصصين فاز توسعه در انجام وظيفه اشان براي scale up و ارائه مقياس صنعتي " فرآيند عمليات پايين دستي" مي نمايد.

3 ) در فاز تحقيق بايد حد و ميزان درجه خلوص لازم با توجه به ميزان ناخالصي هاي موجود از قبيل باكتريها، ويروسها، اسيدهاي نوكلئيك، اندوتوكسين ها و آنتي ژنهاي غير تعيين گردد.

4 ) از آنجا كه كيفيت مواد اوليه اساسي در طرح فرآيند پالايش بسيار مهم است. توصيه و سفارش نوع فروشنده هاي اين مواد از وظائف متخصصين فاز تحقيق است. براي مثال ارائه ويژگي هاي لازم رزين هاي كروماتوگرافي و بهترين توليد كننده آنها در جملة اين وظايف است.

5 ) معرفي آزمون هاي مناسب براي هر محصول پروتئيني با توجه به ويژگي هاي مورد نياز هرمحصول از نظر فعاليت، قدرت عمل و واكنش، پايداري, و يكنواختي.

6) ارائه ويژگي هاي كلية مواد خام اوليه، مواد واسطه ( نمونه هاي بيولوژيك بدست آمده بين مراحل مختلف ) و ماده نهايي ( نمونة نهايي پروتئين تخليص شده ) از جمله وظايف فاز تحقيق مي باشد.

7) پيشنهاد روش مناسب فرمولاسيون و بسته بندي محصول نهايي جهت افزايش پايداري محصول از جمله وظايف فازتحقيق است كه اين پيشنهاد با توجه به مطالعات انجام يافته بر روي حساسيت محصول نسبت به شرايط مختلف انجام مي پذيرد.

ويژگي ها و الزامات فاز توسعه

1) مهمترين وظيفة فاز توسعه انجام بهينه سازي فرايند با توجه به مشخصات و ويژگي هاي محصول و با توجه به روشهاي مختلف بكار رفته در طرح كلي فرايند است كه درجهت ارائه محصول با كيفيت بالا و هزينة پايين انجام
مي پذيرد. ممكن است دراين مرحله تكنيكهايي جايگزين تكنيكهاي قبلي ارائه شده در طرح فرايند گردد.

2) براي انجام كنترل هاي حين فرايند و ارائه ويژگي هاي فرايند در هرمرحله از فرايند ، لازم است كه فرايند پالايش در اندازه هاي بچ مختلف در شرايط متفاوت انجام پذيرد تا اينكه مشخصاتي از قبيل درجة خلوص، ميزان بازدهي و پارامترهاي فرايند نظير دما، pH، رسانايي، پروفايل جذب UV درهرمرحله پالايش مشخص شده و پارامترهاي بحراني فرايند مورد ارزيابي قرار گيرد و دامنة مقبوليت آنها ارائه گردد. اين مرحله جهت ايمن ساختن فرايند از ايجاد تغييرات اساسي بعد از اعمال تغيير در غلظت تركيب اجزاء مواد خام اوليه با توجه به اندازه هاي مختلف آنها، ضروري است.

3 ) ارائه دامنة قابل قبول و ويژگي هاي مواد واسطه در بين مراحل توليد بعد از هرمرحله كروماتوگرافي از وظايف اصلي فاز توسعه مي باشد.

4 ) با توجه به اينكه يكي از منابع آلوده كننده محصول نهايي ذرات جداشده از ستون هاي كروماتوگرافي ، ارائه روشهايي جهت شناسايي اين مواد و حدقابل قبول آنها از وظايف بخش توسعه مي باشد .

5 ) مطالعه نيمه عمر ستونهاي كروماتوگرافي و ارائه روشهايي جهت افزايش پايداري آنها.

6 ) ارائه روش پركردن (Packing) ستون كروماتوگرافي و روشهاي تست ستون از نظر بازدهي و پيشرفت مطلوب از جمله وظايف حساس بخش توسعه مي باشد.

7 ) ارائه روش كار جهت نگهداري دستگاه هاي كروماتوگرافي و ستونهاي كروماتوگرافي كه ارائه روشهاي مؤثر جهت بازيابي ستونهاي كروماتوگرافي، تميز كردن درمحل (Cleaning-in-palce)، بهداشتي كردن (Sanitization-in-place) و روشهاي انباردار و نگهداري (storage) آنها از جمله اين وظايف مي باشد.

8 ) درحين فاز توسعه ويژگي هاي (Specifications) مواد اوليه از جمله رزين هاي كروماتوگرافي و فروشنده هاي اين مواد بايد بصورت مستند نوشته شود و ضمناً روشهاي تست اين مواد و دامنة قابل قبول آنها بصورت مستند ارائه شود.

9) تثبيت روشهاي فرمولاسيون و ارائه روشهاي جايگزين مناسب با توجه به شرايط مختلف دما ، pH و مؤثر بودن محصول از جمله وظايف فاز توسعه است.

10) افزايش مقياس توليد (Scale up) از جمله وظايف مهم فاز توسعه است.

11 ) معرفي امكانات و شرايط مورد نياز از نظر دستگاه ها و مواد مورد نياز فرايند توليدي تأمين كننده نيرو از جمله ديگر وظايف فاز توسعه مي باشد كه همگي بايد با ملاحظات كنترل كيفي و تضمين كيفيت انجام پذيرد.

12 ) قبل از اينكه فرايند طراحي شده به مرحله توليد تحويل داده شود ، اساسي ترين مسئله تهيه و گردآوري سندهاي فرايند با توجه به قوانين سازمان بهداشت جهاني كه با عنوان (Good Manufactaring practice) GMP مطرح است, و اصطلاحاً آنها را (Standard Operating Procedures) SOP مي نامند، مي باشد كه لزوماً بايد براي هر فعاليت در فرايند تخليص تهيه گردد.

الزامات فاز توليد

اساسي ترين وظيفة فاز توليد, تهيه محصول بر اساس نيازهاي بازار است.

جمع بندي نهايي

وجود روشها و تكنيكهاي متفاوت, طراحي " فرآيند عمليات پايين دستي" را با حق انتخابهاي متعددي روبرو ساخته است. برخورداري اين طراحي از ويژگي هاي اصولي يک" فرآيند عمليات پايين دستي" بهينه از اصولي ترين معيارهاي انتخاب اين روش ها است. ساده کردن " فرآيند عمليات پايين دستي" برای به حداقل رساندن زمان توليد, بالا بردن کيفيت در بيشترين حد ممکن, و پايين آوردن هزينه, ويژگي هاي يک طراحي " فرآيند عمليات پايين دستي" بهينه است که بايد در متعادل ترين شکل ممکن با يکديگر در طرح اعمال شده باشند. طراحي اوليه " فرآيند عمليات پايين دستي" بر اساس مطالعات و بررسي حجم و ميزان مورد نياز محصول و تعيين مقياس صنعتي صورت
مي پذيرد, بعد از انتخاب تکنيک ها اين مقياس صنعتي به مقياس تحقيقاتي و آزمايشگاهي scale down شده و طراحی " فرآيند عمليات پايين دستي" دقيقا" بر اساس حجم آزمايشگاهي صورت مي پذيرد و سپس بعد از شناخت تمامي جوانب طراحي در فاز توسعه اين فرايند برای مقياس صنعتی scale up مي گردد.

فصل 2" پارامترهای اساسی در "فرايند عمليات پايين دستي"

2-1- مقدمه

2-2- پارامترهاي مؤثر بر خصوصيات كلي "فرايند عمليات پايين دستي"

2-2-1- درصد بيان (% expression)

2-2-2- درجه خلوص (% Purity)

2-2-3- بازيابي (% Recovery)

2-2-4- بازيابي محصول (Yield)

2-3- پارامترهای دخيل در مراحل فرايند پالايش

2-3-1- متعادل سازي (Equilibration)

2-3-2- اِعمال نمونه (Sample Application)

2-3-3- شستشوي رزين كروماتوگرافي (Washing)

2-3-4- خارج سازي (Elution) يا مرحله دفع (Desorption)

2-3-5- بازيابي (Regeneration)

2-3-6- تميزكردن درمحل (Cleaning-In-Place)

2-3-7- سترون كردن (Sanitization)

2-3-8- نگهداري (Storage)

2-4- پارامترهاي عمليات واحدي

2-4-1- بازماندن Retention

2-4-2- ظرفيت (Capacity)

2-4-3- بازدهي (Efficiency)

2-4-4- انتخابگري (Selectivity)

2-4-5- قدرت جداسازي (Resolution)

2-1- مقدمه

شناخت عوامل و پارامترهايي كه در كنترل و تجزيه و تحليل فرايند پالايش مورد استفاده قرار مي گيرند, به خصوص روشهاي مختلف كروماتوگرافي, يك نياز اساسي و مقدمه اي براي وارد شدن در جزئيات طراحي "فرايند عمليات پايين دستي" است. هدف اين فصل آشنا نمودن کارآموزان با عوامل گوناگون مؤثر بر اين فرايند است و تلاش بر اين است که از وارد شدن به مباحث عميق نظري مرتبط با آنها امتناع شود. علاقمندان به اين مباحث مي توانند به منابعي كه ارائه مي گردد مراجعه و اين مبحث را از ديد تئوري و رياضي دنبال نمايند.

پارامترهاي مؤثر بر "فرايند عمليات پايين دستي" را مي توان در سه دسته مختلف مورد بررسي قرار داد: پارامترهاي مؤثر بر خصوصيات كلي "فرايند عمليات پايين دستي", پارامترهای دخيل در مراحل فرايند پالايش, و پارامترهاي عمليات واحدي.

در اين فصل ابتدا به بررسي پارامترهايي كه ويژگي هاي كلي يك "فرايند عمليات پايين دستي" را بوجود
مي آورند, و به منزلة شناسنامة فرايند هستند، مي پردازيم. اين پارامترها ويژگيهاي فرايند را از ابتدا تا انتها براي دستيابي به هدفی خاص تعيين مي كنند. پارامترهايي نظير ميزان بيان پروتئين (Expression)، درجه خلوص (Purity)، و ميزان بازيابي (Recovery) از اين دسته هستند. دسته دوم پارامترهايي هستند كه بيشتر معرف مراحل انجام فرايند پالايش يا تخليص مي باشند. در اين دسته مي توان به پارامترهايي از جمله متعادل سازي (Equilibration)، اِعمال نمونه(sample loading)، و خارج سازي پروتئين ازستون كروماتوگرافي ( desorption يا Elution) اشاره كرد. دسته سوم پارامترهايي هستند كه از نظر
عمليات واحدی(Unit Operation) در هر روش جداسازي بسيار مهم بوده و درواقع معرف روند جداسازي
مي باشند. از جمله اين پارامترها مي توان به انتخابگري (Selectivity) ، ظرفيت (Capacity) ، و بازدهي (Efficency) اشاره كرد .

در پايان اين فصل انتظار مي رود تا کارآموزان قادر به پاسخ دادن به سئوالات زير باشند:

1- چرا براي طراحي يك "فرايند عمليات پايين دستي" مناسب ، بايد درصد بيان پروتئين قبلاً بهينه شده باشد؟

2- تفاوت Recovery و yield چيست؟

3- مراحل انجام کروماتوگرافي کدامند؟

4- منظور از متعادل سازی رزين کروماتوگرافي چيست؟

5- شستشوي رزين کروماتوگرافي بعد از اِعمال نمونه به چه منظوري انجام مي يابد؟

6- هدف از مرحله دفع يا خارج سازي چيست؟

7- چرا بايد يک ستون کروماتوگرافي بازيابي گردد؟

8- بازدهي بالا در يک ستون کروماتوگرافي به چه معنا است؟

9- قدرت تفکيک يک روش کروماتوگرافي به چه پارامترهايي بستگي دارد؟

10- ظرفيت رزين کروماتوگرافي به چه معنا است؟

11- انتخابگری چيست و به چه عواملي بستگي دارد؟

- پارامترهاي مؤثر بر خصوصيات كلي "فرايند عمليات پايين دستي"

اين پارامترها به منزله شناسنامه فرايند هستند و خصوصيات فرايند از نقطه شروع تا پايان برای رسيدن به محصول مورد نظر را مشخص مي کنند.

2-2-1-درصد بيان (% expression)

پارامتري است كه ميزان توليد و بيان پروتئيني خاص را نسبت به ساير پروتئين هاي توليد شده توسط سلول بيولوژيك مورد نظر نشان مي دهد . با وجود آنکه درصد بيان در "فرايند عمليات بالادستي" كنترل و بهينه مي گردد, اما به عنوان يكي از ويژگي هاي ماده شروع كننده در "فرايند عمليات پايين دستي" از اهميت خاصي برخوردار است, چراكه به شدت بر كارآيي و بازدهي اين عمليات تأثير مي گذارد . از اين رو براي طراحي يك "فرايند عمليات پايين دستي" مناسب ، بايد درصد بيان پروتئين قبلاً توسط متخصصين فرمانتاسيون بهينه شده باشد .

از طرف ديگر لازم به يادآوري است كه بسته به منبع اوليه توليد پروتئين از نظر نوع ميكروارگانيزم و طبيعي يا نوتركيب بودنِ آن, ميزان بيان پروتئين محدود است. بهرحال يكي از مزيتهاي استفاده از تكنيك هاي نوتركيب ( يعني اصلاح يا دستكاري يك ميكروارگانيزم با استفاده از روشهاي مهندسي ژنتيك درجهت توليد و بيان يك محصول خاص ), مخصوصاًَ درمورد ميكروارگانيزمهايي نظير اِشرشياكلي Esherishia coli ، ميزان بيان بالاي پروتئين مورد نظر نسبت به ساير پروتئينهاي توليد شده توسط ميكروارگانيزم مورد بحث است.

2-2-2- درجه خلوص (% Purity)

اين پارامتر در واقع بيان كنندة ميزان جداسازي پروتئين مورد نظر نسبت به مواد ديگر يا ناخالصي هاي ديگر ( از جمله ويروسها ، باكتريها ، پروتئينهاي ديگر ، نوكلئيك اسيدها و اندوتوكسين ها ) است. همانطوريكه درفصل قبل مطرح شد، درجه خلوص يك نمونة بيولوژيك نسبت به دو خصوصيت يعني خلوص عاملي و خلوص شيميايي مطرح مي شود ( رجوع کنيد به 1-2-2-1).

2-2-3- بازيابي (%Recovery)

ميزان بازيافت و مقدار پروتئين خالص شده در فرايند نسبت به مقدار پروتئين اولية موجود درمحصول قبل از فرايند بعنوان بازيابي تعريف مي شود. اين پارامتر مي تواند در مورد هر مرحله خالص سازي مطرح شده و درعين حال به عنوان يك پارمتر كلي تر درمورد كل فرايند تخليص, که شامل چندين مرحله تخليص است, مطرح گردد. بهرحال اين پارامتر بيشتر معياري جهت مقايسه مقدار جرميِ پروتئين بدست آمده از يك فرايند نسبت به مقدار پروتئين موجود در نمونه تخليص نشده است.

2-2-4- بازيابي محصول (Yield)

گرچه واژه yield و Recovery بسيار نزديك به هم بوده و گاه مترادف هم بشمار مي روند, اما واژه yield درواقع عبارت است از ميزان بازيافت پروتئين خالص شده كه داراي فعاليت بيولوژيك بوده و نسبت به مقدار اولية پروتئين قبل از فرايند تخليص مطرح مي شود . بنابراين درمورد بازيابي محصول (yield) تنها مقدار جرم پروتئين مطرح نبوده بلكه اساس, ميزان بازيابي فعاليت محصول بوده و با استفاده از تست هاي مناسب فعاليت (معمولاًIn vitro ) ميزان فعاليت محصول بعد از تخليص محاسبه مي گردد. بنابراين جهت بدست آوردن حداكثر yield براي يك محصول, بهينه سازي فرايند از نظر انجام حداقل مراحل تخليص و كم كردن زمان فرايند بسيار مهم است به طوری که حتي الامكان از عملکرد عواملي كه فعاليت محصول را به خطر مي اندازند, نظير پروتئازها و يا عوامل تخريب كننده ساختار پروتئين, جلوگيري شود . اين درحالي است كه واژه Recovery از نظر بدست آوردن بيشترين مقدار جرم محصول بعد از فرايند پايين دستي مطرح است, كه بازهم با استفاده از حداقل مراحل تخليص سعي مي شود كه ميزان ضايعات محصول درمراحل مختلف به حداقل مقدار ممكن برسد.

2-3- پارامترهای دخيل در مراحل فرايند پالايش

هدف اصلي در روشهاي كروماتوگرافي، جداسازي اجزأ سازنده يك مخلوط از يكديگراست. نمونه مورد نظر با جريان فاز متحرك به محيطي كه حاوي ذرات فاز ثابت است وارد ميشود. در شکل 2-1 نمونه ای محتوي پروتئين مورد نظر از داخل ستون كروماتوگرافي عبور داده شده و با استفاده از ويژگي هاي جذب يا براساس اندازة مولكولي با حركت در بستر ستون كروماتوگرافي از ساير مواد كه بعنوان ناخالصي در نظر گرفته مي شوند ، بايد جدا گردد . دراين سيستم وجود پمپ جهت برقراری جريان فاز متحرک داخل ستون كروماتوگرافي ، آشكارساز UV (UV Detector ) جهت دنبال كردن خروج پروتئين براساس اندازه گيري ميزان جذب خروجي از ستون در طول موج 280nm يا 260nm و ثبت آن توسط دستگاه ثبات (Recorder) بعنوان منحني كروماتوگرام (chromatogram) و دستگاه اندازه گيري ميزان قدرت يوني جريان خروجي از ستون بعنوان ميزان رسانايي (Conductivity) ، اندازه گير pH ، در دماي جريان خروجي از ستون لازم و ضروري است.

شکل2-1- سيستم كروماتوگرافي جهت جداسازي پروتئين مورد نظر با استفاده از يك ستون كروماتوگرافي

با اين توضيح به مراحل مختلف يك روش جداسازي تحت عنوان عمل کروماتوگرافي مي پردازيم. هر يک از اين مراحل به عنوان پارامترهايي هستند که در مراحل فرايند پالايش اثرگذار هستند.

2-3-1- متعادل سازي (Equilibration)

براي اينكه شرايط جداسازي پروتئين مورد نظر در بستر كروماتوگرافي براساس مكانيزم ويژه اي كه در آن روش بخصوص جداسازي درنظر گرفته شده، انجام گيرد و در واقع پروتئين مورد نظر و ذرات ديگر موجود در نمونة بيولوژيك داراي شرايط يكساني از نظر دما، pH، قدرت يوني و تركيب ذرات محلول باشند و از هرگونه شرايط غيرويژه كه مكانيزم عمل كروماتوگرافي را تحت تأثير قرار دهد جلوگيري شود ، لازم است كه ابتدا قبل از ورود نمونه به داخل بستر ستون كروماتوگرافي ، شرايط داخل بستر از نظر عوامل فوق ( دماي pH و غيره ) با شرايط نمونة بيولوژيك محتوي پروتئين كه بصورت محلول است يكسان شود و در اصطلاح بستر كروماتوگرافي متعادل گردد. بدين منظور رزين كروماتوگرافي موجود در ستون با استفاده از يك بافر مناسب كه شرايط بافر در برگيرنده نمونة بيولوژيك را دارد، شستشو مي شود. درحين عمل متعادل سازي, كروماتوگرام حاصل بصورت خطي يك دست و ممتد ظاهر مي شود كه اصطلاحاً خط پايه (Baseline) ناميده مي شود.

2-3-2- اِعمال نمونه (Sample Application)

پس از مرحلة متعادل سازي بستر ستون كروماتوگرافي، نمونة بيولوژيك محتوي پروتئين بصورت يك جريان محلول از طريق پمپ وارد ستون كروماتوگرافي مي شود كه اين مرحله در اصطلاح مرحلة "اعمال نمونه" ناميده مي شود. اين مرحله در روشهاي كروماتوگرافي جذبي، مرحله جذب (adsorption) هم ناميده مي شود, زيرا فرض براين است كه پروتئين مورد نظر به رزين كروماتوگرافي جذب مي شود.

2-3-3- شستشوي رزين كروماتوگرافي (Washing)

پس از مرحلة وارد كردن نمونة پروتئين به داخل فاز ثابت يا بستركروماتوگرافي، لازم است كه بستر كروماتوگرافي با بافر مشابه بافر متعادل سازي با يك يا دو برابر حجم ستون كروماتوگرافي شسته شود تا ذرات و ناخالصي هايي كه بصورت غير ويژه به رزين كروماتوگرافي چسبيده اند از ستون خارج شوند و شرايط براي خروج و جداسازي پروتئين مورد نظر از بقية ناخالصي ها با استفاده از يك بافر ويژه ايجاد گردد. لازم به يادآوري است كه در روش فيلتراسيون ژلي (Gel Filtration) كه مكانيزم جداسازي جذبي نبوده و براساس پديدة نفوذ براساس اندازة مولكولي ( مراجعه شود به فصل 4 بحث فيلتراسيون ژلي ) انجام
مي گيرد، مرحله شستشو در واقع همان مرحلة خارج سازي پروتئين مورد نظر بوده و نيازي به مرحلة بعدي يعني مرحلة دفع (Desorption) نيست و دراين روش بافر شستشو بدون هيچ تغييري عيناً شبيه بافر مرحلة تعادل سازي است و در واقع برای کروماتوگرافي فقط از يك بافر استفاده مي شود . به همين دليل اين نوع كروماتوگرافي داراي شرايط Isocratic مي باشد يعني بافر هيچگونه واكنشي با ماتريس ندارد. اين درحالي است كه در روشهاي جذبي ممكن است كه بافر مرحلة شستشو ، فقط مق�