وزارت بهداشت درمان و آموزش پزشكي

شبكه بيوتكنولوژي پزشكي كشور

كارگاه آموزشي تخليص پروتئينها

درس 2 

فصل3- عمليات پيش پالايش پروتئين ها

3-1- مقدمه

3-2- انواع محصولات پروتئيني باتوجه به نوع منبع اولية توليد كننده

3-3- عمليات پيش‌پالايش محصولات برون سلولي

3-3-1- جداسازي سلولي

3-3-1-1- سانتريفوژ

3-3-1-2- ميكروفيلتراسيون به روش فيلتراسيون با جريان متقاطع:

3-3-2- كاهش حجم

3-3-2-1- اولترافيلتراسيون

3-3-2-2- روشهاي جذب

3-3-2-3- رسوب‌دهي

3-4- عمليات پيش‌پالايش محصولات درون سلولي

3-4-1- درو كردن و جمع‌آوري سلول‌ها

3-4-2- شكست سلولي

3-4-2-1- روشهاي مكانيكي

3-4-2-2- روشهاي غير مكانيكي

3-4-3- جداسازي مواد جامد

3-4-4- آماده‌سازي نمونه قبل از كروماتوگرافي

3-5- نتيجه گيري

3-1- مقدمه

در طراحي "فرايند عمليات پايين دستي" روشهايي مقدماتي و اوليه برای جداسازي بعضي محصولات از مادة خام اوليه باتوجه به منبع اولية توليد كنندة پروتئين پيش‌بيني و در نظر گرفته مي شوند. در واقع اين روشها به‌عنوان مراحلي هستند كه قبل از انجام پالايش توسط روشهاي مختلف كروماتوگرافي، مادة اوليه را جهت انجام آن آماده سازي مي‌كنند. اهميت اين مجموعه عمليات كه اصطلاحا" پيش‌پالايش ناميده مي شوند در اين است كه اولا" مادة اولية حاوي محصول را بصورت محلول با شرايط مناسب از نظر pH،‌ ميزان قدرت يوني و دما به ستونهاي كروماتوگرافي معرفي مي‌كنند. ثانيا" با حذف نسبي ناخالصي‌هايي نظير اسيدهاي نوكلئيك، چربي‌ها، و ذرات جامد از كثيف شدن ستونهاي كروماتوگرافي جلوگيري مي‌كنند؛ اين مسئله تأثير مهمي در كاهش هزينه‌هاي مربوط به تميز كردن ستون كروماتوگرافي و هزينه‌هاي عملياتي ناشي از افزايش فشار مقاوم درحين فرايند كروماتوگرافي دارد. از طرفي ديگر حذف نسبي ناخالصيها كارآيي ستون كروماتوگرافي را بالا برده و باعث افزايش طول ‌عمر ستون كروماتوگرافي مي‌شود. ثالثا" با كاهش حجم مادة اوليه, زمان "فرايند عمليات پايين دستي" را کوتاه مي کند. بالاخره حذف نسبي عوامل تخريب كنندة ساختار پروتئيني نظير پروتئازها از دلايل ديگر لزوم استفاده از فرايند پيش‌پالايش است.

آنچه كه در اين فصل مورد بررسي قرار مي‌گيرد معرفي روشهاي اوليه و مقدماتي جهت پالايش نسبي پروتئينها باتوجه به نحوه توليد بصورت درون سلولي يا برون سلولي آنها در منبع توليد کننده است. در اين فصل ضمن معرفي هر يک از اين روش ها , جايگاه, کاربرد و مکانيزم عملکرد اصلي آنها تشريح خواهد شد و از پرداختن به مباحث نظري صرف امتناع خواهد شد. علاقمندان براي دستيابي به اطلاعات بيشتر مي‌توانند به منابعي كه در انتهاي فصل ارايه مي‌شود مراجعه نمايند.

در پايان اين فصل كارآموزان بايد قادر به پاسخگويي به سؤالات زير باشند:

1-    تفاوت محصولات درون سلولي و بيرون سلولي از نظر فرايند پيش پالايش چيست؟

2-    روشهاي مناسب براي جداسازي سلولها و مواد جامد کدامند؟

3-    روشهاي مناسب جهت كاهش حجم محلول بيولوژيك حاوي پروتئين کدامند؟

4-    روشهاي مناسب جهت جداسازي سلول محتوي پروتئين بعد از عمليات تخميرکدامند؟

5-    روشهاي معمول و رايج جهت شكست سلولي کدامند؟

6-    روشهاي مناسب جهت رسوبدهي محصول پروتئيني يا ناخالصي‌هاي موجود در محلول بيولوژيك چيست؟

7-    روشهاي حل كردن محصول پروتئيني كه بصورت Inclusion bodies در درون ميكروارگانيزم توليد شده است, کدامند؟

- انواع محصولات پروتئيني باتوجه به نوع منبع اولية توليد كننده

منابع اصلي توليد محصول پروتئيني يا منابع نوتركيب و يا منابع غير نوتركيب هستند. در منابع نوتركيب با اعمال تغييراتي در ساختار ژنتيک ميكروارگانيزم, محصول موردنظر از طريق رشد و تكثير ميكروارگانيزم در شرايط مناسب انبوه‌سازي مي‌شود. ميكروارگانيزم‌هاي متفاوتي مي‌تواند در اين روش استفاده گردند كه عبارتند از باكتريها، مخمرها، قارچ‌هاي رشته‌اي، سلولهاي حشرات و سلولهاي پستانداران. استفاده از روشهاي غيرنوتركيب نظير استفاده از سلولهاي اوليه (Stem cell) كشت شده از سلولهاي انساني، جوجه، ميمون و يا خرگوش جهت توليد واكسن، استفاده از هيبريدوما (Hybridomas) براي توليد منوكلونال آنتي‌بادي و نيز استفاده از پلاسما، بافتهاي پستانداران و بافتهاي گياهي از ديگر روشهاي توليد محصولات پروتئيني مي‌باشد. اينكه كداميك از اين منابع بايد جهت توليد يك پروتئين خاص مورد استفاده قرار گيرند بحثي استراتژيك است كه توسط متخصصين كل فرايند توليد از قسمت‌هاي "فرايند عمليات بالادستي" و " فرايند عمليات پايين دستي" و متخصصين ژنتيك و بيولوژي مولكولي مورد تصميم‌گيري قرار مي‌گيرد و فراتر از بحث فرايند عمليات پايين دستي است. اما از نظر كلي طراحي " فرايند عمليات پايين دستي"  به فاكتورهايي نظير نوع ميكروارگانيزم و منبع اولية در دسترس و با در نظر گرفتن قوانين سازمان بهداشت جهاني جهت هر نوع محصول خاص، اولويتهای عملياتي فرايند توليد از نظر هزينه, بازدهي و ملاحظات مربوط به هدف از توليد محصول، مزيتها و معايب هر منبع از نظر ميزان بيان محصول، كيفيت بيان محصول از نظر ساختار پروتئيني، سرعت رشد و بسياري از عوامل ديگر بستگي دارد.

هرحال محصولات پروتئيني صرفنظر از نوع منبع و روش توليد به دو صورت در محيط بيولوژيك توليد مي‌شوند:

الف) درون سلولي  Intra – Cellular   
 

ب ) برون سلولي   Extra – Cellular

فرايند پيش‌پالايش جهت جداسازي نسبي محصولات درون سلولي و برون سلولي متفاوت بوده و بصورت كلي مي‌توان آن را در شكل زير مشاهده كرد:

- عمليات پيش‌پالايش محصولات برون سلولي

وقتي محصولات برون سلولي مورد بحث قرار مي‌گيرند در واقع منظور حالتي است كه پروتئين خارج از سيستم توليد كنندة سلولي قرار دارد و معمولا" با غلظت کمي از پروتئين در داخل يك محلولِ با حجم بالا سروكار داريم. لذا دراين مورد ابتدا بايد سلولهاي موجود در محلول حذف شده وسپس در مرحلة بعد جهت تغليظ محلول محتوي پروتئين حجم محلول توسط روشهاي مناسب كاهش داده شود. اين مراحل همانطور كه در شكل 3ـ1 نمايش داده شده است به ترتيب جداسازي مواد و ذرات جامد و كاهش حجم نامگذاري شده‌اند كه در اينجا مورد بحث قرار مي‌گيرند.

3-3-1- جداسازي سلولي

بهترين روشها جهت جداسازي سلولها از محلول محتوي پروتئين استفاده از سيستم‌هاي سانتريفوژ پيوسته و روش فيلتراسيون با جريان متقاطع (Cross-flow-filtration) مي‌باشند.

3-3-1-1- سانتريفوژ

بطور كلي روش سانتريفوژ عبارتست از جداسازي جامد از مابع تحت تأثير نيروي گريز از مركز براساس اختلاف دانيتة وزني آنها. سانتريفوژها انواع مختلفي دارد كه در سه مقياس پيوسته   flow thorough Centrifuge) و يا (Contionus، سانتريفوژ با مقياس نيمه صنعتي (Pilot-Scale Centrifuges) و سانتريفوژهاي آزمايشگاهي Fixed Volume Centrifuges) و يا (Laboratory Centrifuges )تقسيم‌بندي مي‌گردد. جهت جداسازي سلولها باتوجه به حجم بالا, استفاده از سانتريفوژ پيوسته پيشنهاد مي‌گردد كه در سه صورت ديسكي (Stacked disks in bowls)، چمبر (Concentric Chamber) و سيلندر (long Cylinder or tube) تقسيم‌بندي مي‌شوند. بهرحال با استفاده از سانتريفوژ بازدهي جداسازي سلولها بسيار بالا بوده ولي هزينة اين دستگاهها مخصوصا" در مقياسهاي بالاي توليدي بسيار بالا است.

شكل 3ـ2ـ بصورت تصويري مكانيزم جداسازي در سيستم‌هاي سانتريفوژ پيوسته را در سه نمونه متفاوت آن نشان مي‌دهد.

شكل 3ـ2ـ طراحي‌هاي مختلف براي سانتريفوژ پيوسته  ديسكي  لوله‌اي و  چمبر

3-3-1-2- ميكروفيلتراسيون به روش فيلتراسيون با جريان متقاطع:

عمل فيلتراسيون از روشهاي ديگري است كه جهت جداسازي ذرات جامد از محيط مايع مورد استفاده قرار مي‌گيرد و از طريق عبور دادن جريان محلول محتوي ذرات جامد از يك محيط واسطه (كه بصورت‌هاي مختلف غشاء و يا محيط متخلخل مي‌تواند باشد) تحت فشار عمل جداسازي را انجام مي‌دهد.

فيلتراسيون انواع مختلف دارد كه از جملة آنها روشهاي اولترافيلتراسيون و ميكروفيلتراسيون و يا فيلتراسيون معمولي مي‌باشند و تفاوت آنها در اندازة حفره‌ها يا تخلخل‌هاي موجود برروي محيط جداسازي و اندازة ذرات قابل جداسازي است. در فيلتراسيون با جريان متقاطع يا عمودي, مايع بر روي فيلتر پمپ مي‌شود.

شكل 3ـ3ـ بصورت شماتيك يك سيستم فيلتراسيون با جريان متقاطع را نشان مي‌دهد.

شكل 3ـ3ـ فيلتراسيون با جريان متقاطع

استفاده از روش فيلتراسيون براي جداسازي باكتريها كه امكان جداسازي آنها از طريق سانتريفوژ بدليل اختلاف كم دانسيتة اين ذرات با محيط مايع وجود ندارد، توصيه مي‌شود. به هرحال روش فيلتراسيون هم داراي معايبي از قبيل امكان ايجاد مقاومت در مقابل عمل فيلتراسيون از طريق گرفتگي فيلتر توسط ذراتي كه بر روي آن جمع مي‌شوند, است. بعضي مواقع برای جداسازي سلولها, تركيبي از هردو روش سانتريفوژ و فيلتراسيون پيشنهاد مي‌گردد.

3-3-2- كاهش حجم

مرحلة بعد از جداسازي سلولها در مورد محصولات برون سلولي كاهش حجم مي‌باشد. باتوجه به اينكه غلظت پروتئين در داخل محلول مخصوصا" در مورد سيستم‌هاي توليد كنندة پروتئيني ترشحي (مانند سلولهاي پستانداران) پائين است، بايد براي کاهش زمان جداسازي توسط کروماتوگرافي, حجم محلول محتوي محصول پروتئيني را كم كرده و آن را تغليظ نمود. به اين منظور از روشهاي مختلفي نظير اولترافيلتراسيون, روشهاي جذب, و عمل رسوبدهي

 (Precipitation) استفاده مي‌گردد كه در اينجا اختصارا" به هركدام از اين روشها مي‌پردازيم.

3-3-2-1- اولترافيلتراسيون

مكانيزم عمل در اين روش با مكانيزم روش ميكروفيلتراسيون يكسان بوده و تنها تفاوت در اندازة ذرات جداشدني و محيط جداكننده است. معمولا"در اولترافيلتراسيون براي تغليظ,  محصول پروتئيني از نمك و مواد آلوده كننده ديگر با استفاده از يك محيط جدا كننده, كه به صورت غشاء يا بسترهاي فيبري متخلخل Hollow Fiber Cartridge موجود است، جدا مي شود.

 اندازة منافذ (كه اصطلاحا" Cut-Off ناميده مي‌شود) باتوجه به اندازة محصول پروتئيني و كوچكتر از آن انتخاب ميگردد و دامنه 1000 تا 100000 دالتون را در بر ميگيرد.    

شكل 3ـ4 نمونة يك سيستم اولترافيلتراسيون را كه با استفاده از فشار گاز خنثي بر روي محلول محتوي پروتئين از بالا عمل كرده و باعث عبور ذرات زير Cut-Off   غشاء كه در قسمت ته ظرف نصب گرديده است، عمل تغليظ را انجام مي‌دهد.

شكل 3ـ4ـ سيستم اولترافيلتراسيون Stirred – Cell با استفاده از غشاء متخلخل

- روشهاي جذب

باتوجه به اينكه روشهاي كروماتوگرافي جذبي نظير كروماتوگرافي به روش تعويض يون (Ion Exchange Chromatography)  و كروماتوگرافي با استفاده از جاذبة هيدروفوبيك (Hydrophobic Interaction Chromatography) توانايي جذب محصول و در نتيجه تغليظ محلول محتوي پروتئين موردنظر را دارند، ، لذا مي‌توان با استفاده از انتخاب رزين مناسب باتوجه به آنچه در فصل 4 در مورد مكانيزم و نحوة استفاده از روشهاي كروماتوگرافي ارايه خواهد گرديد فاز محلول محتوي پروتئين را به هركدام از اين روشها معرفي نموده و ضمن تغليظ پروتئين يك جداسازي نسبي را هم انجام داد. در اين روش نكتة مهم استفاده دبي (Flow rate) بالا بسيار حايز اهميت مي‌باشد تا بتواند زمان انجام پروسة را كم كرده و فعاليت پروتئازها را نيز به حداقل مقدار ممكن برساند.

- رسوب‌دهي

يكي از مهم‌ترين تكنيكها جهت كاهش حجم و تغليظ محصول پروتئيني استفاده از روشها مختلف رسوب دهي مي‌باشد كه به طرق مختلف از قبيل رسوب‌دهي بوسيلة نمك، حلالهاي آلي حلالهاي پليمري اين عمل مي‌تواند انجام پذيرد و شناخته

شده‌ترين روش براي انجام عمل رسوبدهي استفاده از نمك است كه با افزايش مقدار نمك حلاليت پروتئيني كم شده و در نتيجه عمل رسوبدهي يا   Salting –out انجام مي‌پذيرد. سري هوف ميستر  قدرت رسوبدهي نمك‌ها را به‌صورت ذرات آنيوني و كاتيون بصورت آراية زير نشان مي‌دهد:  

Anions: Po4^3-, So4 ^2-, CH3Coo ^-, Cl ^-, Br ^-, No₃ ^-, Clo₃ ^-, I ^-, SCN ^- 

Cations: NH4⁺, K⁺, Na⁺, gunidine Cl(CH2)₃⁺

نمكهايي مانند آمونيوم فسفات و آمونيوم سولفات كه در سمت چپ اراية فوق قرار مي‌گيرند اصطلاحا" به(Anti-Chaotropic) آنتي كائوتروپيك    موسومند كه از معروفترين نمكهاي عامل Salting-Out  هستند.  مكانيزم عمل آنها از طريق هيدراته كردن ذرات نمك افزوده شده و در نتيجه دور كردن مولكولهاي آب از سطوح هيدروفوب  پروتئين‌ها است, درنتيجه اين سطوح هيدروفوب به هم پيوسته و رسوب مي‌دهند.

در رسوبدهي توسط حلال آلي با افزايش حلال‌ آلي، قدرت حلاليت مولكولهاي باردار آب دوست پروتئيني در محيط آبي كم شده و باعث بهم پيوستن ذرات مولكولي و رسوبدهي آنها مي‌شود. در واقع اين مكانيزم بسيار شبيه مكانيزم رسوبدهي پروتئينها در نقطة ايزوالكتريك (Iso-electric Point) در غلظتهاي پايين نمك است. معروفترين حلال آلي اتانل است, كه در جداسازي اجزاء پروتئينهاي پلاسمايي بسيار مورد استفاده قرار مي‌گيرد.

استفاده از پليمرهاي آلي (Organic Polymers) براي افزايش رسوبدهي ذرات پروتئيني نيز يكي ديگر از روشهاي بسيار معمول رسوب‌دهي است. مكانيزم رسوبدهي توسط اين مواد شبيه استفاده از حلال‌ آلي و از طريق كاهش فعاليت محيط آبي است. معروفترين ماده اي كه در اين دسته قرار دارد و استفاده از آن بسيار مرسوم است Poly Ethylen Glycol است كه با وزن مولكولي بالاي 4000 بخصوص در مورد پروتئين هاي پلاسمائي بسيار موثر است.    (اولين پروتئين پلاسمايي كه توسط PEG رسوب داده شده فيبرينوژن است).به هر حال استفاده از مواد پليمري آلي داراي اين عيب است که محلول آنها داراي ويُکوزسکوزيته بالا بوده و عملا" استفاده از اين مواد را جز در مورد PEG  غيرممكن مي‌سازد.

جدول 3ـ1ـ برخي از عوامل رسوبدهي را با ذكر نوع و خواص آن بصورت خلاصه ارائه مي کند.

هرحال آنچه كه در مورد استفاده از روشهاي رسوبدهي بخصوص در مقياس‌هاي صنعتي قابل ذكر است عدم بازدهي بالاي اين روشها مي‌باشد زيرا اولا" استفاده از عوامل نمكي يا آلي هزينه‌هاي زيادي را  از نظر قيمت مواد در مقياس‌هاي صنعتي در بر دارد و ثانيا" مسئله بسيار مهم ايجاد مشكلات دفع ضايعات يا فاضلاب در صورت استفاده از اين مواد در يك مقياس صنعتي مي‌باشد.

- عمليات پيش‌پالايش محصولات درون سلولي

باتوجه به اينكه در محصولات پروتئيني كه در داخل سلول توليد مي‌شوند مسئله اصلي ابتدا جمع‌آوري سلول محتوي پروتئين است. بنابراين در اولين مرحله عمل دروكردن سلول (Cell Harvesting) انجام پذيرفته و بعد از انجام عمل شكست سلولي با اطلاع از محلول يا غير محلول بودن پروتئين موردنظر عمليات پيش‌پالايش با روشهاي مناسبي كه در اينجا معرفي مي‌گردند, ادامه مي‌يابد.

درو كردن و جمع‌آوري سلول‌ها (Cell Harvesting)

گرچه هردو روش استفاده از سانتريفوژ و ميكروفيلتراسيون مي‌توانند براي جمع‌آوري سلول‌هاي محتوي پروتئين قابل استفاده ‌باشند, اما باتوجه به اينكه در استفاده از روش فيلتراسيون با جريان متقاطع، دبي جريان به مرور و پس از جمع‌آوري

30% كل ذرات سلولي كاهش مي‌يابد و بازدهي اين روش پايين مي‌آيد,  استفاده از عمل سانتريفوژ توصيه مي شود. بهرحال نوع سيستم سانتريفوژ به مقياس فرايند بستگي دارد كه باتوجه به حجم محلول بيولوژيك بعد از عمليات تخمير انتخاب مي‌گردد. استفاده از سيستم‌هاي سانتريفوژ پيوسته داراي بازدهي بسيار بالا بوده اما سبب افزايش هزينه‌هاي ثابت خواهد شد.

3-4-2- شكست سلولي

بعد از جمع‌آوري سلولهاي محتوي پروتئين، اولين مرحله شكستن و درهم ريختن ديوارة سلولي و خارج كردن پروتئين از داخل سلول است. اين عمليات عمدتا" به دو روش انجام مي‌پذيرد: روشهاي مكانيكي و روشهاي غيرمكانيكي.

3-4-2-1- روشهاي مكانيكي

سه روش عمدة مكانيكي جهت شكست سلولها عبارتند از: wet milling، High Pressure Homogenizor  و روش Ultrasound، البته باتوجه به پيشرفت تكنولوژي روشهاي ديگري نيز وجود دارند كه عمومي نبوده و لذا از ذكر آنها در اينجا خودداري مي‌كنيم.در روش wet milling در واقع اساس كار استفاده از دانه‌هاي شيشه‌اي مي‌باشد كه با استفاده از يك سيستم محوري هم‌زن  در داخل يك محفظه  همانند چرخ گوشت, دانه‌ها هم زده و به سمت جلو رانده مي شوند و نمونة بيولوژيك كه از ابتدا وارد اين محفظه شده است در فضايي كه دانه‌هاي شيشه‌اي قرار دارند قرار گرفته و در نتيجة ايجاد تنش

 حاصل از حركت دانه‌ها و با انتقال اين تنش به سلول، ديوارة سلولي خرد مي‌شود. فاكتورهاي زيادي در اين روش مؤثر هستند كه به اختصار عبارتند از: سرعت هم‌زن، سرعت ورود نمونة بيولوژيك به داخل محفظه، اندازة دانه‌ها، دانسيتة سلولي، وزن دانه‌ها، دما، طراحي هم‌زن و ساختار هندسي محفظة آسياب.

از طرف ديگر براي ميكروارگانيزم‌هاي مختلف تعداد دفعات ورود و خروج نمونة بيولوژيك به داخل دستگاه بسيار مهم بوده و بايد بهينه شود. اين دستگاهها در مقياس‌هاي متفاوت آزمايشگاهي، نيمه صنعتي و صنعتي بوده و لذا هركدام طراحي خاص خود را دارند. از جمله مزيت‌هاي اين دستگاه قابليت استفادة آن براي تمام انواع ميكروارگانيزم‌ها مي‌باشد. اما از معايب آن وجود متغيرهاي كنترلي زياد و هزينه‌هاي طراحي و تلفات دانه‌هاي شيشه‌اي در پروسه‌هاي متوالي مي‌باشد.

از ديگر روشهاي بسيار موفق در شكست سلولي, استفاده از سيستم High Pressure Homagonizor   است. اين سيستم‌ها از دو قسمت اصلي تشكيل شده‌اند:

 الف) قسمت پمپ پيستون كه ايجاد كننده يك فشار بالا است. ب) شير كنترل كه كار كنترل و تنظيم فشار را در دستگاه انجام مي‌دهد.

اساس كار در اين دستگاه به اين ترتيب است كه ابتدا نمونة بيولوژيك از طريق يك قيف و بصورت خودكار به داخل سيلندر دستگاه مكش مي‌ددشود

(مانند سيستم High Pressure Homagenizer / شركت Niro-Suavia, Italy، كه در شكل 3ـ5ـ نشان داده شده است)

و يا بصورت دستي در داخل سيلندر قرار مي‌گيرد (مانند سيستم French-Press) و سپس با قرار گرفتن پيستون بر روي نمونة بيولوژيك،   جريان مايع از طريق يك سوراخ ريز كه در انتهاي سيلندر قرار دارد با فشار به طرف نازل خروجي هدايت مي‌شود كه در اين قسمت شير كنترل عمل كرده و با اعمال يك فشار بالا سلولها از دو طرف نازل خارج شده و ضمن برخورد با ديواره نازل و يكديگر عمل شكست انجام مي‌پذيرد. البته باتوجه به وجود اختلاف فشار شديد در قبل و بعد از خروج از سيلندر, اختلاف دماي محسوسي در حين خروج نمونه ايجاد شده و در واقع دماي خروجي بالا مي‌رود. لذا كنترل افزايش دما مخصوصا" در مواردي كه ساختار پروتئيني به دما حساس باشد بسيار مهم است. شكل 3ـ6ـ مكانيزم خروج را با استفاده از دو نوع شير كنترل كه يكي داراي سرپهن و ديگر داراي لبة تيز و چاقويي است, نشان مي‌دهد.

البته استفاده از سيستم High Pressure Homogenzer (HPH) در مورد باکتريهاي کوچک گرم مثبت که داراي ديواره ضخيم هستند, در فشارهای کمتر از 55 Mpa توصيه نمي شود. اما در مورد مخمر و باكتريهاي مانند E.coli استفاده از اين سيستم در شرايط عملكردي متفاوت مرسوم است. به هرحال در اين روش نيز معمولا" بايد نمونة سلولي بيش از يكبار از سيستم عبور داده شود و تعداد اين دوره‌ها بايد بهينه و كنترل شود. مزيت اين سيستم نسبت به روش wet milling تعداد پارامترهاي كمتر قابل كنترل است كه عبارتند از: فشار عملياتي، طراحي قسمت شير كنترل، دانسيتة سلول و دما.

ستفاده از روش Ultra sound در مقابل روشهاي Wet milling و HPH   به خصوص در مقياسهاي نيمه‌صنعتي و صنعتي مرسوم نبوده و تنها در مقياسهاي آزمايشگاهي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. اساس كار در اين روش ايجاد پالسهاي صوتي با فركانس بسيار بالا  و ايجاد تنش در داخل محلول سلولي و انتقال اين تنش‌ها به ديوارة سلولي و درنتيجه شكست آنها مي‌باشد. بهرحال در اين روش زمان ايجاد پالسها و تعداد دفعات ايجاد پالسها در كنترل عمليات شكست سلولي بسيار مهم مي‌باشد. استفاده از اين روش داراي بازدهي داراي بازدهي بالا نبوده و در مورد عمليات توليد كه باهدف افزايش مقياس صنعتي انجام مي‌شود پيشنهاد نمي‌گردد.

3-4-2-2- روشهاي غير مكانيكي

روشهاي غير مكانيكي در واقع  روشهايي آزمايشگاهي هستند و باتوجه به كاربرد محدود فقط با اختصار آنها را نام مي‌بريم. بطور كلي دو دسته روش غيرمكانيكي براي انجام شكست سلولي وجود دارد كه عبارتند از روش Lysis و روش Desiccation. در روش Lysis عمل تخريب يا اضمحلال ديوارة سلولي مي‌تواند با استفاده از آنزيم (مانند ليزوزيم)، مادة شيميايي (مانند استفاده از گلايسين ، آنتي بيوتيك‌ها و يا دترجنت‌هاي كاتيوني يا آنيوني) و نهايتا" از طريق تغيير ساختار فيزيكي سلول (مانند استفاده از شوك اسمزي و يا عمل ذوب و انجماد( انجام گردد.
روش Desiccation  از طريق روشهاي مختلف خشك‌كني مانند Air drying، Vaccume drying، Freeze drying و يا Solven drying انجام مي‌شود. به هرحال استفاده از هيچكدام از اين روشها در مورد عملياتهاي شكست سلولي در مقياس نيمه‌صنعتي يا صنعتي و يا عملياتهايي كه در جهت افزايش مقياس انجام مي‌شوند به‌دليل عدم بازدهي بالا پيشنهاد نمي‌گردد و صرفا" جنبة آزمايشگاهي دارند.

3-4-3- جداسازي مواد جامد

باتوجه به اينكه بعد از عمليات شكست سلولي, انبوهي از مواد جامد مانند تكه‌هاي خرد شدة ديوارة سلولي وجود دارد كه بايد جداسازي شوند, روشهايي نظير سانتريفوژ و ميكروفيلتراسيون براي جداسازي ذرات جامد مي‌توانند مورد استفاده قرار گيرند. در اين مرحله مسائلي كه مشكل عمده را ايجاد مي‌كنند افزايش و سيكوزيته و مقدار زياد ذرات كلوئيدي و معلق ريز كه ممكن است جداسازي آنها مشكل باشد و نيز مهمترين مسئله امكان كاهش فعاليت درصورت طولاني بودن زمان عمليات است.

 براي رفع برخي از اين مشكلات در برخي موارد, افزودن لخته سازها (Flacculants) قبل از عمليات شكست سلولي پيشنهاد مي‌گردد. جهت كاهش فعاليت پروتئازها كه مستقيما" فعاليت محصول پروتئيني را پايين مي‌آوردند، افزودن ممانعت كننده‌هاي فعاليت پروتئاز (بعنوان مثال EDTA با غلظت حدود 5mM و يا برخي آنزيم‌ها

نظير phenyl methyl – Sullonyl ploride باغلظت0.5-1mm) در داخل بافر محتوي سلول بيولوژيك پيشنهاد مي شود. يكي از مهم‌ترين مسايل بعد از شكست سلولي امكان دستيابي به پروتئين بصورت غيرمحلول يعني جداسازي آن در فاز جامد بعد از عمل شكست سلولي است. بطوركلي پروتئين‌هايي كه داراي ميزان بيان (توليد در داخل ميكروارگانيزم) بالايي مي‌باشند و عمدتا"داراي پيوندهاي  S-S در ساختار دوم خود هستند، بصورت غيرمحلول يا اصطلاحا"
Inclusion bodies در سلول توليد مي‌شوند كه ساختار اصلي خود را از دست داده (Unfolded) و بايد پس از مرحلة شكست سلولي ابتدا توسط عوامل مناسب حل شده (Solubilizing) و سپس طي فرايندي خاص ساختار اوليه خود را مجددا"به‌دست آورند .(Refolding)) بنابراين بعد از مرحلة شكست سلولي و جداسازي فاز جامد و محلول از يكديگر با روشهايي نظير سانتريفوژ ابتدا بايد پروتئين از نظر محلول يا غيرمحلول بودن چك شود. درصورت غيرمحلول بودن پروتئين ابتدا پروتئين با استفاده از عوامل مختلفي مانند دترجنت‌ها (مثل Triton x-100، SDS و يا Tween-80) و يا عوامل Chaotropic (مثل اوره و گوانيدين هيدروكلرايد) بصورت محلول يا Solubilized درآيد. معمولا" اوره
(4-8M) و گوانيدين (4-6M) به‌عنوان موفق‌ترين عوامل حل كنندة پروتئين‌هاي غيرمحلول پيشنهاد مي‌گردندبعد از مرحلة حل كردن پروتئين، مسئله اصلي احياء ساختار اولية پروتئين (Refolding) در كنار فرايند تخليص مي‌باشد. عمليات Refolding در واقع يك تكنولوژي خاص و پيشرفته است كه باتوجه به ساختار هر پروتئين طراحي مي‌شود. روشهاي مختلفي جهت اين عمليات وجود دارد كه عمدتا"براساس مكانيزم اكسيداسيون و احياء عمل مي کنند. عمل احياء مي‌تواند با استفاده از موادي نظير مركاپتواتانل (Mercaptoethanol) و يا (DTT) 1,4- Dithioerythriol انجام پذيرد. و بعد از آن عمل اكسيداسيون از طريق روشهايي نظير ترقيق (Dilution) و يا فيلتراسيون ژلي (Gel Filtration) انجام مي‌پذيرد. البته همانطوري كه گفته شد تكنولوژي

تكنولوژي Refolding بسيار متنوع بوده و در مورد هر پروتئين بصورت خاص عمل مي‌شود. يكي از شناخته شده‌ترين روشهاي  Refoldingحذف اوره و يا گوانيدن به‌عنوان عامل حل كننده بعد از عمليات Solubilizing است, كه اين كار مي‌تواند با استفاده از روش فيلتراسيون ژلي يا ترقيق و يا دياليز انجام پذيرد. عمل دياليز در مورد روشهايي كه در جهت نيمه‌صنعتي يا صنعتي شدن انجام مي‌گيرد، توصيه نمي‌گردد. به هرحال باتوجه به اهميت روش Refolding و تكنيكهاي مختلفي كه امروزه براي اين فرايند طراحي شده است، لازم است كه مبحث Refolding بصورت اختصاصي‌تر دنبال گردد و علاقمندان مي‌توانند جهت دنبال كردن اين بحث به منابع ارائه شده در انتهاي فصل مراجعه نمايند. در ادامه بحث جداسازي مواد جامد بايد اضافه كرد كه تكنيكهاي ديگري غير از روشهاي سانتريفوژ و ميكروفيلتراسيون (از طريق فيلتراسيون با استفاده از جريان متقاطع) نيز وجود دارند كه از جمله مي‌توان به روش استخراج با استفاده از دو فاز مايع ) و استفاده از جاذبهاي جامد(Solid – adsorbents) اشاره كرد. در روش استخراج مايع – مايع مبناي كار استفاده از دوفاز مايع كه داراي دو پليمر متفاوت مانند دكستران (Dextran) و
پلي اتيلن گلايكول (PEG) و يا يك پليمر و يك نمك (مانند PEG  به‌عنوان پليمر و پتاسيم فسفات به‌عنوان نمك) است، به‌نحوي كه اجزاء ديوارة سلولي، نوكلئيك اسيدها و بخشي از پروتئين‌هاي آلاينده در فاز پاييني قرار گرفته (مثلا” در مورد پليمر / نمك، نمك فاز پايين و پليمر فاز بالايي مي‌باشد) و پروتئين موردنظر در فاز بالايي قرار مي‌گيرد. البته در اين روش فاكتوري به نام ضريب جداسازي بسيار مهم است كه حتما" بايد براي پروتئين موردنظر به اندازة كافي بزرگ باشد تا در فاز بالايي (پليمر) قرار گيرد. پس از اين روش استفاده از يك تكنيك اولترافيلتراسيون براي جداسازي پليمر مثلا"

PEG در مورد سيستم نمك / پليمر) توصيه مي‌شود تا اينكه ضمنا" عمل تغليظ محصول را هم انجام دهد. در روش ديگر استفاده از مواد جاذب نظير رزين‌هاي تبادل يوني با استفاده از يك سيستم هم‌زن يا استفاده از بسترهاي سيال شده

 (Fluidized bed) مي‌تواند به‌عنوان روش مناسبي جهت جداسازي اوليه مواد جامد و ناخالصي‌هاي عمدة ناشي از شكست سلولي از پروتئين مورد نظر، مورد استفاده قرار گيرند.

3-4-4- آماده‌سازي نمونه قبل از كروماتوگرافي

پس از انجام مراحلي كه در مورد هر دو نوع محصول درون سلولي و برون سلولي در بخشهاي قبلي به اختصار توضيح داده شد، مسئلة عمده آماده كردن نمونه براي انجام اولين مرحلة كروماتوگرافي است. باتوجه به اينكه فاكتورهايي نظير دما، pH، ميزان قدرت يوني (Conductivity)، ويسيكوزيته، مسئلة وجود عوامل تخريب كنندة ساختار سلولي نظير پروتئازها، توليد محصول بصورت غير محلول محلول Inclusion bodies، مقدار بالا چربي‌ها و اسيدهاي نوكلئيك در بازدهي و كارآيي روشهاي كروماتوگرافي تأثير مستقيم دارند. لذا تمامي تلاشها در اين جهت است كه فاكتورهاي فوق كنترل و بصورت قابل قبولي درآيند تا امكان انجام كروماتوگرافي را فراهم كرده و بازدهي "فرايند عمليات پايين دستي" را در كل بالا ببرد. شكي نيست با انجام برخي از روشهايي كه قبلا" ذكر شد مسايلي از  قبيل Inclusion bodies از طريق عمليات محلول‌سازي Solubilizing، جداسازي مقدار قابل ملاحظه‌اي از اسيدهاي نوكلئيك و چربي‌ها با استفاده از روشهاي رسوبدهي، استفاده از روشهاي جذب، روشهاي سانتريفوژ، فيلتراسيون و استخراج مايع – مايع و جلوگيري از فعاليت پروتئازها با استفاده از ممانعتت كننده‌هاي پروتئاز تا حدود زيادي قابل حل مي‌باشد. اما فاكتورهايي نظير pH، دما، قدرت يوني و ويسكوزيته باتوجه به روش كروماتوگرافي موردنظر بايد كنترل و تنظيم گردد.

در مواردي كه كنترل دما مورد نياز باشد و پروتئين موردنظر نسبت به دماي بالا حساسيت داشته باشد, استفاده از سيستم اتاق سرد براي انجام فرايند توصيه مي‌گردد. البته در اين مورد بايد ويسكوزيتة محلول محتوي پروتئين پايين باشد تا از ايجاد فشارهاي مقاوم درحين روش كروماتوگرافي جلوگيري شود. براي كنترل و سيكوزيته از روشهايي نظير
رسوب دهي نوكلئيك اسيدها يا افزايش  آنزيم DNase جهت تخريب ساختار نوكلئيك اسيدها و يا ترقيق مي‌توان استفاده كرد. در مواردي كه پايداري پروتئين اجازة فعاليت در دماي اتاق را مي‌دهد, اگر مسئله ويسكوزيته مشكل‌زا باشد، كار نكردن در دماي سرد مي‌تواند از بروز مشكلات مربوط به ويسكوزيتة بالا تا حدودي جلوگيري كند.

درصورتي كه پايين بودن قدرت يوني جهت انجام روش كروماتوگرافي موردنظر باشد, مثلا" در روش كروماتوگرافي تعويض يوني, در اين صورت مي‌توان از روشهايي نظير ترقيق و يا فيلتراسيون  براي كاهش غلظت نمك و قدرت يوني در محلول محتوي پروتئين موردنظر استفاده كرد. البته درصورت بالا بودن قدرت يوني استفاده از روشهاي كروماتوگرافي كه قابليت كارآيي در اين شرايط را دارند, مانند روش كروماتوگرافي هيدروفوبيك .