وزارت بهداشت درمان و آموزش پزشكي
شبكه بيوتكنولوژي پزشكي كشور
كارگاه آموزشي تخليص پروتئينها
درس4
ادامه فصل4
استراتژي تخليص پروتئين ها به وسيله روشهاي کروماتوگرافي
4-4- كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك (HIC)
روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك از خواص سطوح هيدروفوبيك برای جداسازي بيومولكولها و به خصوص پروتئينها, استفاده ميكند. در سال 1348 تيسيليوس (Tiselius) اين روش را در يك مقاله تحت عنوان جداسازي جذبي بر اساس روشSalting – out براي اولين بار معرفي كرد. گرچه استفاده از اين روش تا سالهاي دهة 70 چندان مرسوم نبود و به ندرت به كار گرفته شد، اما از اين تاريخ به بعد ساخت رزينهاي متنوع هيدروفوبيك امكان استفاده از اين روش را در سطح بسيار وسيعي فراهم ساخت بهطوريکه امروزه اين روش بصورت رايج در مورد تخليص بسياري از پروتئينها به كار گرفته ميشود.
جهت بررسي روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك در اين قسمت، ابتدا به معرفي مكانيزم جداسازي در اين روش و پارامترهاي موثر و اساسي كه بر فرايند جداسازي در اين روش تأثير ميگذارند ميپردازيم. سپس ويژگيهاي فرايند، عملكرد و جايگاه آن در كل "فرايند عمليات پايين دستي" را مورد بررسي قرار ميدهيم.
در پايان نمونههاي عملي از كاربرد اين روش در جداسازي پروتئين را با استفاده از رزينهاي هيدروفوبيك معرفي خواهيم كرد.
4-4-1- مكانيزم جداسازي در روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك و پارامترهاي مؤثر بر آن
تمام پروتئينها در ساختار خود داراي سطوح هيدروكربني هستند كه ميتوانند با سطوح يا عوامل مشابه جاذبه هاي هيدروفوبيك ايجاد نمايند. لذا در شرايط محيطي كه پروتئينها بتوانند اين سطوح را بصورت قابل دسترسي قرار دهند، ميتوانند به عواملي كه داراي ساختار هيدرو كربني و در نتيجه داراي خاصيت هيدروفوبيك باشند, جذب شوند و پيوندهاي غيرقطبي برقرار نمايند.
سطوح هيدروفوب در محيط آبي بافر به سمت داخل پروتئين متمايل مي شوند, زيرا مولكولهاي آب كه در كنار گروه هاي هيدروفيل موجود در سطح پروتئين قرار دارند به نحوي پروتئين را در بر ميگيرند كه سطوح هيدروفوب نميتواند خود را در سطح مولكول عرضه نمايند.
بنابر اين همانطوريكه در فصل پيشپالايش توضيح داده شد با استفاده از خاصيت Salting – out با افزايش مقدار محدود از نمكهايي نظير آمونيوم سولفات ميتوان مولكولهاي آب را از اطراف پروتئين كنار زده و سطوح هيدروفوب را در معرض دسترسي عواملي با ساختار مشابه قرار داد. اين مسئله اساس آمادهسازي نمونة پروتئيني جهت استفاده از روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك است و از طرف ديگر رزين كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك داراي ليگاندهايي است كه ساختار هيدروكربني در شكلهاي مختلف حلقههاي بنزني، گروههاي الكيلي و يا هر دوي اين گروهها را دارد و ميتواند با سطوح هيدروفوب قابل دسترسي در سطح پروتئينها جاذبه ايجاد نمايد.
بديهي است هرچه جاذبة هيدروفوب موجود بين سطوح پروتئيني و ليگاند رزين قويتر باشد, قدرت جذب بيشتر بوده و لذا در مرحلة خارجسازي (desorption) پروتئينهاي داراي جاذبة قويتر ديرتر از ستون خارج ميشوند. مكانيزم مرحلة خارجسازي براساس كاهش غلظت نمك موجود در محيط داخل ستون كروماتوگرافي و در نتيجه كاهش خاصيت Salting out فراهم ميگردد. بدين ترتيب ملاحظه ميشود كه روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك از نظر مكانيزم خارج سازي پروتئين دقيقا" با يك استراتژي عكس روش كروماتوگرافي تعويض يوني عمل ميكند. در روش كروماتوگرافي تعويض يوني با افزايش غلظت نمك در محيط داخل ستون كروماتوگرافي, عمل خروج انجام ميشد درحالي كه در روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك كاهش غلظت نمك اساس مكانيزم خروج را تشكيل ميدهد.
پارامترهايي كه جهت كنترل فرايند جداسازي در اين روش بايد مورد توجه قرار گيرند عبارتند از: غلظت و نوع نمك, گروه عاملي, PH محيط,و دما.
4-4-1-1- غلظت و نوع نمك:
باتوجه به تقسيمبندي كاتيونها و آنيونهاي نمكهاي مختلف در رابطه با افزايش قدرت Salting – out بنابراين نمكهاي مختلف با غلظتهاي متفاوت ميتوانند تأثير متفاوتي را از نظر افزايش ميزان Salting – out و در نتيجه قدرت جاذبة يوني بين سطوح هيدروكربني قابل دستيابي با ليگاند موجود بر روي رزين كروماتوگرافي ايجاد نمايند(رجوع شود به بحث Salting – out فصل 3). نمكهايي نظير سولفات آمونيوم و سولفات سديم بسيار مؤثرتر از نمكهايي نظير NaCl ميتوانند سطوح هيدروفوب پروتئيني را در سطح پروتئين در معرض گروههاي عاملي قرار دهند.
بديهي است افزايش غلظت نمك نيز باعث افزايش اثر Salting – out خواهد شد. به هرحال غلظت نمك در داخل بافر تعادل سازي و نمونة پروتئيني بايد يكسان باشد تا شرايط يكساني را از نظر محيطي در داخل بستر رزين كروماتوگرافي و محلول محتوي پروتئين ايجاد نمايد.
ضمنا" غلظت نمك بايد بهينه شود زيرا غلظت كم نمك ميتواند تأثيرپذيري كمي را از نظر Salting – out ايجاد كرده و از طرف ديگر غلظت زياد نمك ممكن است سبب كاهش قدرت انتخابگري رزين در جذب پروتئين مورد نظر از طريق جذب ميزان بيشتري از ناخالصيها و آلايندهها ، احتمال سختتر شدن عمل خروج و جداسازي پروتئين از رزين كروماتوگرافي در مرحلة خروج (desorption) ، ايجاد مشكلات زيست محيطي جهت تصفية فاضلاب و افزايش هزينة فرايند بدليل هزينة بالاي استفاده از نمك در فرايندهاي توليد خواهد شد. معمولا" غلظت 1M نمك آمونيوم سولفات به عنوان يك شرايط بهينه جهت روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك در آمادهسازي نمونة پروتئيني و محلول تعادلسازي پيشنهاد ميگردد.
4-4-1-2- گروه عاملي:
رزينهاي كروماتوگرافي كه در روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك مورد استفاده قرار ميگيرند از دو قسمت عمده تشكيل ميشوند: ماتريس جامد و گروه عاملي – ماتريس جامد كه عمدتا" ساختار كوپليمري دارند بصورت دانههاي ريز با اندازههايي مختلف ساخته شدهاند. گروه عاملي بصورت گروههاي آلكيلي (خطي)، حلقههاي بنزني و يا تركيبي از اين دو بر روي پايه جامد رزين تثبيت گرديده است.
در واقع اين گروه عاملي به عنوان ليگاند نقش اصلي را در جذب سطوح هيدروفوب
پروتئيني برعهده دارد. بنابراين قدرت جاذبة هيدروفوبيك به قدرت گروه عاملي در
كنار ميزان دسترسي به سطوح هيدروفوبيك بستگي دارد. هنگامي كه گروه عاملي از جنس
گروههاي آلكيلي باشد، هرچه تعداد اين گروهها و يا تعداد اتمهاي كربن بيشتر
باشد قدرت جاذبه بيشتر خواهد بود. رزينهايي نظير
Butyl – Sepharose Fast
Flow
و Octyl – Sepharose Fast flow
كاربرديترين رزينهايي هستند كه در ساختار خود به ترتيب گروههاي عاملي بوتيل
(C4)
و اكتيل (C8)
عنوان ليگانه در اختيار دارند.
رزينهايي نظير Phenyl – Sepharose Fast Flow نيز از ديگر رزينهاي كروماتوگرافي بوده كه با در اختيار داشتن گروه عاملي فنيل بهعنوان ليگاند، در روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك بهصورت متداول و رايج مورد استفاده قرار ميگيرند البته مقايسة بين گروههاي عاملي آلكيلي و فنيلي از نظر ميزان ايجاد جاذبه همواره امكان پذير نبوده و در مورد پروتئينهاي متفاوت ليگاندهاي مختلفي ميتوانند بهعنوان گروه عاملي مناسب عمل كنند. ممكن است دليل اين مسئله، عامل ممانعت فضايي و امكان دستيابي سطوح هيدروفوب پروتئيني به گروههاي عاملي باشد
4-4-1-3- pH
اثر pH
بصورت شخصي قابل ارايه نبوده اما بصورت كلي با افزايش
pH
ميزان آبگريزي (Hydrophobicty)
پروتئينها
كم
ميشود
كه شايد
بدليل
افزايش
تيتراسيون
نمونه
و
در نتيجه فعال كردن گروههاي
آبدوست
(Hydrophil)
باشد.
از
طرف
ديگر
با
كاهش pH
ميزان آبگريزي
افزايش مي
يابد.
بنابر اين پروتئين هايي كه نمي توانند در pH خنثي (نزديك 7) به ستون هيدروفوبيك متصل شوند با كاهشpH ميتوان آنها را به خوبي در پروسة كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك تخليص كرد. با اين وجود، نتايج كار محققين نشان ميدهد كه دامنة pH بين 5.5-8 داراي جاذبة هيدروفوبيك بسيار پائينتري نسبت به محدودة PH>8 يا PH<5.5 است.
4-4-1-4- دما:
در مورد دما هم برخي گزارشها افزايش خاصيت جاذبة هيدروفوبيك را با افزايش دما نشان ميدهد، كه البته با مسئله افزايش جاذبههاي و اندروالسي در هنگام افزايش دما مطابقت دارد. اما از طرف ديگر برخي نتايج نشان از كاهش جاذبة هيدروفوبيك با افزايش دما دارد. بنابراين در اين مورد هم بايد دماي مطلوب پروسة كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك بهينه گردد.
4-4-2- ويژگيهاي كروماتوگرافي
باتوجه به اينكه تمام پروتئينها در ساختمان خود داراي سطوح هيدروفوبيك بدليل وجود گروههاي هيدروكربني و غير قطبي در زنجيرة آمينواسيدهاي ساختمان اول پروتئين ميباشند (40 تا 50% سطوح قابل دسترسي پروتئين غير قطبي است)، بنابراين همگي بصورت بالقوه ميتوان از خاصيت جاذبة هيدروفوبيك در روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك استفاده كرده و عمل جداسازي را امكان پذير نمود. لذا روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك نيز همانند روش كروماتوگرافي تعويض يوني يك روش فراگير بوده و مختص يك پروتئين بهعنوان پروتئين با خاصيت هيدروفوب نميباشد.
از
طرف
ديگر
روش كروماتوگرافي
با
جاذبة
هيدروفوبيك
به
عنوان يك
روش
مكمل
ميتواند
در
كنار
روشهاي كروماتوگرافي
تعويض
يوني،
فيلتراسيون
ژلي
(Gel Filtration)
و كروماتوگرافي ميل تركيبي
(Affinity Chromatograophy)
مورد استفاده قرار گيرد. از طرف ديگر باتوجه به اينكه اين روش يك روش جذبي
است,
بنابراين محدوديتي از نظر حجم نمونه براي استفاده از روش كروماتوگرافي با جاذبة
هيدروفوبيك وجود ندارد و روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك قدرت جداسازي
بسيار بالايي داشته و
براحتي
ميتوان با استفاده از گراديان خطي كاهش غلظت نمك در بستر كروماتوگرافي، موفقيت
خروج پروتئين موردنظر را نسبت به بقية پروتئينها يا ناخالصيها شناخته و سپس
با استفاده از يك برنامة شستشوي مرحله به مرحله، عمل جداسازي را بهخوبي انجام
داد. باتوجه به ظرفيت بالاي رزينهاي كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك
ميتوان بخوبي مقادير بالاي پروتئيني را با استفاده از اين روش تخليص كرد.
يكي از مهمترين ويژگيهاي روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك قابليت كاربرد آن به عنوان اولين روش كروماتوگرافي در "فرايند عمليات پايين دستي" مي باشد. زيرا معمولا" قدرت رسانايي بيشتر محلولهاي بيولوژيك بالا (در حدود 15-30ms/cm )بوده و بخوبي ميتوان از روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك بهعنوان اولين روش استفاده كرده و از عملياتهايي نظير نمكزدايي (Deselting) و يا فيلتراسيون (Diafiftration) و ترقيق (Dilution) احتراز كرد. با اين حال روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك لزوما" بهعنوان اولين روش مورد استفاده قرار نگرفته و ميتواند بصورت روش مكمل با روشهايي كه قبلا” ذكر شد بهعنوان روش واسطه در پروسة DOP قرار گيرد، به اين ترتيب با استفاده از روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك ميتوان بسياري از ناخالصيها را حذف كرد.
4-4-3- نمونة عملي استفاده از روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك در "فرايند عمليات پايين دستي"
در تخليص پروتئين نوتركيب استرپتوكيناز (Streptokinase) از روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك در مرحلة نهايي استفاده گرديده تا اينكه درجة خلوص از مقدار 75% بعد از مرحلة كروماتوگرافي تعويض يوني بهميزان 93% بعد از مرحلة كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك ارتقاء يابد. "فرايند عمليات پايين دستي" طراحي شده براي تخليص پروتئين استرپتوكيناز يك پروسة بسيار موفق بوده كه از دو روش كروماتوگرافي تعويض يوني و كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك در كنار يكديگر جهت انجام فرايند تخليص استفاده گرديده است.
نمونة استفاده از رزين Butyl – TSK جهت تخليص پروتئين استروپتوكيناز
كاري انجام شده در مركز CIGB هاوانا كوبا
نوع رزين: Butyl – TSK
مقدار رزين: 5 ml
مقدار نمونة پروتئيني قبل از كروماتوگرافي: 18.72 mg
مقدار محصول: 6.24 mg
Flow rate: 2 ml/min
(AC) (Affinity
Chromatography)
بيش از سي سال است كه استفاده از روش كروماتوگرافي ميل تركيبي به صورت وسيع مرسوم شده است. اين روش نقشي منحصر بفرد را در تكنولوژي جداسازي بيومولکول ها ايفا كرده است، زيرا تنها روشي است كه عمليات جداسازي را براساس نقش بيولوژيك مولكول يا ساختار شيميايي خاص هر ذره امكان پذير ميسازد.
در سال 1910 روش كروماتوگرافي ميل تركيبي براي جذب آميلاز (Amylase) به استارچ (Starch) غيرمحلول مورد استفاده قرار گرفت، اما به دليل وجود مشكلات جدي در انتخاب رزين و ليگاند مناسب, با استقبال چنداني مواجه نشد. در سالهاي بعد تكنولوژي ساخت رزين عملا" اين امكان را فراهم آورد كه از رزينهاي كروماتوگرافي و ليگاندهاي متنوعي كه براساس ميل تركيبي عمل كرده و ميتوانند به صورت ويژه جهت جذب طيف وسيعي از بيومولکول هاي بكار روند، استفاده كرد.
در اين بخش بعد از شناخت اساس روش كروماتوگرافي ميلتركيبي به معرفي عوامل مؤثر و مهم در فرايند جداسازي در اين روش ميپردازيم. در عين حال، ليگاندهاي متفاوتي كه در روش كروماتوگرافي ميلتركيبي براي جذب بيومولکول هاي خاص مورد استفاده قرار ميگيرند را معرفي ميكنيم. همچنين ويژگيهاي اين روش را از نظر پارامترهاي اساسي فرايند و نيز نقش اين روش در "فرايند عمليات پايين دستي"را مورد بررسي قرار ميدهيم. در انتها، نمونههاي عملي از كاربرد اين روش را در جداسازي پروتئينها ذكر مينماييم.
4-5-1- اساس كروماتوگرافي ميلتركيبي (AC)
كروماتوگرافي ميلتركيبي يك روش جذبي است كه در آن يك ليگاند خاص كه جاذبة بيولوژيك اختصاصي با يك بيومولکول يا يك دسته از بيومولکول ها دارد، از يك طرف بر روي يك پاية جامد (ماتريس) تثبيت شده و از طرف ديگر بيومولکول موردنظر را جذب ميكند (شكل 4ـ4).
واكنش برگشت پذير بين ليگاندو بيومولکول
الف)مرحلة تثبيت ليگاند بر روي پاية جامد رزين
ب) مرحلة جذب بيومولکول و ايجاد پيوند كووالان با ليگاند
ج) مرحلة جداسازي بيومولکول از ليگاند
شكل 4ـ4ـ اساس كروماتوگرافي ميلتركيبي
همانطوريكه در شكل مشخص شده است اساس روش بر پايه يك واكنش برگشتپذير كه به صورت پيوند كووالان بين ليگاند و بيومولکول موردنظر صورت ميگيرد,استوار است. بنابراين پس از انتخاب يك ليگاند مناسب كه توانايي ايجاد پيوند كووالان اختصاصي با بيومولکول موردنظر را داشته باشد، بايد ابتدا ليگاند مذكور را بر روي يك پاية جامد تثبيت نموده, سپس شرايط جذب بيومولکول اختصاصي را به ليگاند موردنظر فراهم كرده و در پايان عمل جداسازي ليگاند از بيومولکول موردنظر را با استراتژيهاي مناسب انجام داد.
تركيبات متفاوتي بهعنوان ليگاند در روش کروماتوگرافي ميل جذبي قابل استفاده هستند كه هركدام توانايي ايجاد جاذبه بيولوژيك با تركيبات خاصي را داشته و بهخوبي ميتوانند در جداسازي اين تركيبات بكار روند(جدول 4-1).
جدول 4ـ1ـ برخي از تركيبات که ميتوانند بهعنوان ليگاند براي تخليص مورد استفاده قرار گيرند
| تركيبات مربوطه | ليگاند |
| تركيبات مشابه، ممانعت كنندهها، كوفاكتورها | آنزيم |
| آنتيژن، ويروس، سلول | آنتيبادي |
| پلي ساكارايد، گليكوپروتئين، گيرندههاي سطح سلولي، سلول |
لكتين (Lectin) |
| هيستونها، اسيدهاي نوكلئيك، پليمرازها، پروتئينهاي متصل شونده | اسيدهاي نوكلئيك |
| دريافت كنندهها، پروتئين هاي حامل | هورمونها و ويتامينها |
| پروتئينهاي ويژه سلولي، لكتين | سلولها |
| پروتئينهاي داراي هيستيدن و سيستين |
يونهاي فلزي يا بار مثبت مانند Ni2+، Zn2+, Ca2+ |
به هرحال، روش کروماتوگرافي ميل جذبي باتوجه به استفاده از يك جاذبة بيولوژيك ميتواند بدون محدوديت در حجم نمونه، به خوبي عمليات كروماتوگرافي را انجام دهد و تنها بايد مقدار بيومولکول، و اختصاصا" پروتئين موردنظر در داخل نمونة ، متناسب با ظرفيت رزين كروماتوگرافي باشد تا از اِعمال بيش از اندازة نمونة موردنظر (Over loading) احتراز گردد. به همين دليل، اين روش در مواقعي كه حجم نمونة اوليه زياد باشد يا نياز به رقيق كردن نمونة اوليه احساس گردد، ميتواند به خوبي مورد استفاده قرار گيرد و همانند روشهايي نظير IEC يا HIC يك روش مناسب براي تغليظ نمونة موردنظر به شمار ميآيد. به علاوه روش کروماتوگرافي ميل جذبي داراي اين مزيت ويژه است كه به دليل استفاده از جاذبة بيولوژيك كه معمولا" بسيار قوي ميباشد، داراي قدرت انتخابگري (Selectivity) و ميزان بازيابي (Recovery) بسيار بالايي است. در عين حال اين روش تا اندازهاي قدرت تفكيك و درجة خلوص را بالا ميبرد كه ميتوان در دو مرحله از تركيبي از آن و سپس فيلتراسيون ژلي استفاده كرد و پروتئين موردنظر را تخليص نمود. شايد مهمترين ضعف روش کروماتوگرافي ميل جذبي امكان خروج ليگاند در مرحلة دفع همراه با پروتئين مورد نظر باشد كه ميتواند سبب ايجاد واكنشهاي جانبي و مشكلات جدي گردد كه حتما" بايد در مراحل بعد آشكار و حذف شود.
حال برخي از پارامترهايي كه قويا" در كنترل عمل تخليص توسط روش كروماتوگرافي ميل تركيبي تأثير ميگذارند مورد بررسي قرار ميدهيم.
4-5-1-1- ماتريس ياپاية جامد پليمري:
در روش کروماتوگرافي ميل جذبي ابتدا بايد ليگاند موردنظر بر روي يك پايه جامد (ماتريس) كه داراي ساختار پليمري و به صورت دانه هاي ريز ( با طيفي از اندازه هاي متفاوت) است، تثبيت گردد. خصوصيات اين ماتريس بسيار مهم است و انتخاب ماتريس مناسب ميتواند در افزايش قدرت تثبيت ليگاند بر روي پاية جامد از طريق ايجاد اتصال كووالان با گروه هاي موثر موجود بر روي ماتريس كمك نمايد. البته بايد توجه نمود كه اين اتصال بايد برگشت پذير بوده و بعدا" بتوان ليگاند را از ماتريس توسط روش مناسب جدا كرده و در صورت نياز از ماتريس براي اتصال ليگاند ديگري استفاده نمود. از طرف ديگر بايد اندازة تخلخلهاي موجود بر روي دانههاي رزين (شبكة جامد) به نحوي باشد كه ليگاندهاي تثبيت شده را به نحو موثري در دسترس پروتئين يا بيومولکول قرار دهد. بنابراين ساختار يك ماتريس مناسب و اندازة تخلخلها ميتواند بهخوبي در افزايش ميزان اتصال ليگاند و همچنين افزايش ظرفيت جذب بيومولکول كمك نمايد. رزينهايي نظير Sepharose 4B بهنحو چشمگيري داراي اين خاصيت هستند كه علاوه بر افزايش قدرت اتصال ليگاند و ظرفيت جذب، كمترين جاذبة غير اختصاصي را با بيومولکول دارند. به علاوه رزينهاي داراي پايه Sepharose در شرايط عملكردي, از نظر دبي جريان و pH، بسيار پايدار هستند. بطور كلي بايد در انتخاب رزين مناسب در شرايط عملكردي سخت از نظر pH، دما، وجود تركيباتي نظير دترجنتها و تركيبات آلي، و استفاده از مواد کائوتروپيک مانند گوانيدين هيدروكلرايد دقت نمود.
4-5-1-2- ليگاند:
يك ليگاند مناسب براي استفاده در يك روش کروماتوگرافي ميل جذبي بايد داراي دو خصوصيت مهم باشد: اولا" داراي جذب اختصاصي و درعين حال برگشت پذير با بيومولکول مورد نظر باشد. ثانيا" گروههاي عاملي ليگاند بايد بهنحوي باشند که ليگاند درعين موفقيت در عمل تثبيت بر روي پاية پليمري، فعاليت بيولوژيك ويژة خود را از دست ندهد.
معمولا” براي بررسي خاصيت جذب مواد يك ثابت تفكيك تعريف ميكنند كه همان ثابت واكنش پيوند دو ماده در شرايط برگشت پذير است. و برحسب واحد غلظت بيان ميشود. در مورد ليگاندهاي مورد استفاده در روش كروماتوگرافي ميل تركيبي نيز ثابت تفكيك بايد در دامنه M 10-8_10-4باشد. درصورتي كه ثابت تفكيك از M 10-4بزرگتر باشد، قدرت پيوند کووالان بين ليگاند (L) و بيومولکول موردنظر (S) آنقدر زياد خواهد بود كه بعد از خارج كردن ناخالصيها از ستون كروماتوگرافي، جداكردن بيومولکول در مرحلة دفع (desorption) از ليگاند و بسيار مشكل بوده و شرايط خارجسازي بسيار سخت خواهد بود. در صورتي كه ثابت تفكيك ليگاند و بيومولکول از M 10-8كمتر باشد قدرت جاذبة اختصاصي آنچنان بالا نبوده و درنتيجه خاصيت انتخابگري و قدرت تفكيك ستون کروماتوگرافي در روش كروماتوگرافي ميل تركيبي پايين خواهد آمد. به طور كلي اگر هيچ نوع اطلاعاتي از نظر قدرت جذب ليگاند بيومولکول موجود نباشد معمولا" يك روش سعي و خطا براي انتخاب ليگاند مناسب پيشنهاد ميگردد.
از طرف ديگر، در توضيح خاصيت دوم ليگاند، بايد گفت كه ساختار رزين بايد به نحوي باشد كه درصورت وجود چندين گروه عاملي در ساختار ليگاند، اتصال و تثبيت ليگاند بر روي پاية جامد بهنحوي انجام گردد كه حتيالامكان گروههاي مؤثر در جاذبة بيولوژيك ليگاند – بيومولکول درگير نشده و بتوانند عمل جاذبة اختصاصي را بهخوبي انجام دهند.
4-5-1-3- بازوي اتصال:
باتوجه به مسئلة ممانعت قضايي و امكان عدم دستيابي ليگاند موردنظر به گروههاي موردنياز جهت تثبيت بر روي شكبة پليمري و نيز تأثير عامل ممانعت فضايي در دستيابي مناسب بيومولکول به ليگاندهاي تثبيت شده، وجود بازوهاي اتصال (Spacer arm) برروي ماتريس جامد پيشنهاد شده است. بدينترتيب ليگاند موردنظر برروي اتصال قرار گرفته ميتواند تأثير عامل ممانعت فضايي را كاهش دهد. اين مسئله بخصوص در مورد استفاده از ليگاندهايي با اندازة كوچك (نظير كوفاكتورها در تخليص آنزيمها) داراي اهميت فراوان است.
استفاده از يك بازوي اتصال، تثبيت ليگاند بر روي ماتريس جامد كه از نوع Sepharose ميباشد را تسهيل كرده و از طرف ديگر اتصال بيومولکول با ليگاند تثبيت شده نيز راحتتر انجام ميگيرد. بايد توجه داشت كه طول بازوي اتصال كه از جنس زنجيرههاي آلي است بايد بهينه باشد. درصورتي كه طول بازوي اتصال كوتاه باشد، بازوي اتصال عملا” كارآيي خود را از دست خواهد داد. در حالت عكس اگر بازوي اتصال بيش از حد بلند باشد باتوجه به اينكه جنس آن از زنجيرههاي آلي است، ميتواند با بيومولکول هايي كه بصورت طبيعي داراي گروههاي آلي و هيدروكربني در ساختار خود هستند،جاذبة هيدروفوبيك ايجاد نمايد و بازدهي كل سيستم را پايين خواهد آورد.
4-5-1-4- تثبيت ليگاند بر روي ماتريس جامد و فعال سازي رزين:
باتوجه به اهميت ليگاند در يك روش جذبي بديهي است كه انتخاب رزين مناسب و شرايط فعالسازي و تثبيت ليگاند برروي ماتريس جامد از اهميت فوقالعادهاي برخوردار است لذا در انتخاب پروتكل مناسب عمل تثبيت ليگاند در كنار شرايط ويژه رزين كروماتوگرافي ، پايداري فيزيكي و شيميايي و وجود يا عدم وجود بازوي اتصال نيز برروند عمليات كروماتوگرافي ميل جذبي تأثير ميگذارد. بديهي است هر شركت سازندة رزين كروماتوگرافي ويژگيهاي رزين توليد شده را نيز ارايه ميدهد و جهت آگاهي از پروتكلهاي فعالسازي اين رزينها و خواص رزين ميتوان به اين پروتكلها مراجعه كرد. در اينجا برخي از رزينهاي مشتق شده از Sepharose كه توسط شركت Pharmacia , LKB توليد شده است، معرفي شده و خواص مربوط به آنها به اختصار آمده است كه جهت مطالعة بيشتر ميتوان به كاتالوگها و بروشورهاي اين كمپاني كه در اينجا بهعنوان منبع نيز ذكر شدهاند مراجعه كرد.
ـ رزين: CNBr – activated sepharose 4B و اين رزين كه با سيانوژن برمايد (CNBr) فعال شده است توانايي تثبيت ليگاندهايي كه داراي گروهها آميني نوع اول ميباشند به راحتي با سرعت و با ايمني بالا بوسيلة يك واكنش لحظهاي و سريع تثبيت شوند.
ـ رزين Tresyl – activated sepharose 4B كه با ترسيل (Tresyl) فعال شدهاند توانايي تثبيت و پيوند لحظهاي ليگاند را از طريق گروههاي آميني ياتيول را دارند.
ـ CH Sepharose 4B , AH Sepharose 4B كه هر دو داراي يك بازوي اتصال با 6 اتم كربن بوده و عمل تثبيت ليگاند را از طريق گروههاي بهترتيب كربوكسيل و آميني فراهم مينمايند.
ـ Activated CH Sepharose 4B كه داراي يك بازوي اتصال 6 كربني بوده و با در اختيار داشتن يك استر (ester) فعال قابليت تثبيت آني از طريق گروههاي آميني را دارد.
ـ Activated Thial Sepharose 4B كه با در اختيار داشتن يك بازوي اتصال بصورت يك گلوتاتيون عمل تثبيت بازگشت پذير پروتئينها را از طريق گروههاي تيول آزاد فراهم مينمايد.
4-5-1-5- ويژگي ليگاند از نظر نوع جاذبة اختصاصي
ليگاندهاي قابل استفاده در اين روش طيف وسيعي را در بر ميگيرند و براي تخليص هر بيومولکول (در اينجا پروتئين) ميتوان باتوجه به ساختار بيومولکول موردنظر يك ليگاند مناسب را انتخاب كرد. به هرحال ليگاندهاي مورد استفاده در روش کروماتوگرافي ميل جذبي به دو دسته كلي تقسيم ميشوند: ليگاندهاي داراي جاذبة اختصاصي به يك نوع پروتئين خاص (Mono specific adsorbent) و ليگاندهاي داراي جاذبة اختصاصي به يك گروه از پروتئينها (group specific adsorbent). در مورد دستة اول، ليگاند موردنظر فقط جاذبة اختصاصي به يك پروتئين خاص داشته و نميتواند براي پروتئين ديگري مورد استفاده قرار گيرد. مثلا” استفاده از آنتيبادي مونوكلونال جهت تخليص يك آنتيژن خاص در تخليص پروتئينها مرسوم است و داراي قدرت تخليص و انتخابگري بسيار بالايي ميباشد. در اين مورد ذكر اين نكته مهم است كه درصورتي كه تهيه ليگاند موردني