نسخه قابل چاپ درس 1 (فصل 1و2 )

2-3- پارامترهای دخيل در مراحل فرايند پالايش

هدف اصلي در روشهاي كروماتوگرافي، جداسازي اجزأ سازنده يك مخلوط از يكديگراست. نمونه مورد نظر با جريان فاز متحرك به محيطي كه حاوي ذرات فاز ثابت است وارد ميشود. در شکل 2-1 نمونه ای محتوي پروتئين مورد نظر از داخل ستون كروماتوگرافي عبور داده شده و با استفاده از ويژگي هاي جذب يا براساس اندازة مولكولي با حركت در بستر ستون كروماتوگرافي از ساير مواد كه بعنوان ناخالصي در نظر گرفته مي شوند ، بايد جدا گردد . دراين سيستم وجود پمپ جهت برقراری جريان فاز متحرک  داخل ستون كروماتوگرافي ، آشكارساز UV (UV Detector ) جهت دنبال كردن خروج پروتئين براساس اندازه گيري ميزان جذب خروجي از ستون در طول موج 280nm يا 260nm و ثبت آن توسط دستگاه ثبات (Recorder) بعنوان منحني كروماتوگرام (chromatogram) و دستگاه اندازه گيري ميزان قدرت يوني جريان خروجي از ستون بعنوان ميزان رسانايي (Conductivity) ، اندازه گير pH ، در دماي جريان خروجي از ستون لازم و ضروري است.

 شکل2-1- سيستم كروماتوگرافي جهت جداسازي پروتئين مورد نظر با استفاده از يك ستون كروماتوگرافي

با اين توضيح به مراحل مختلف يك روش جداسازي تحت عنوان عمل کروماتوگرافي مي پردازيم. هر يک از اين مراحل به عنوان پارامترهايي هستند که در مراحل فرايند پالايش اثرگذار هستند.

2-3-1- متعادل سازي (Equilibration)

براي اينكه شرايط جداسازي پروتئين مورد نظر در بستر كروماتوگرافي براساس مكانيزم ويژه اي كه در آن روش بخصوص جداسازي درنظر گرفته شده، انجام گيرد و در واقع پروتئين مورد نظر و ذرات ديگر موجود در نمونة بيولوژيك داراي شرايط يكساني از نظر دما، pH، قدرت يوني و تركيب ذرات محلول باشند و از هرگونه شرايط غيرويژه كه مكانيزم عمل كروماتوگرافي را تحت تأثير قرار دهد جلوگيري شود ، لازم است كه ابتدا قبل از ورود نمونه به داخل بستر ستون كروماتوگرافي ، شرايط داخل بستر از نظر عوامل فوق ( دماي pH و غيره ) با شرايط نمونة بيولوژيك محتوي پروتئين كه بصورت محلول است يكسان شود و در اصطلاح بستر كروماتوگرافي متعادل گردد. بدين منظور رزين كروماتوگرافي موجود در ستون با استفاده از يك بافر مناسب كه شرايط بافر در برگيرنده نمونة بيولوژيك را دارد، شستشو مي شود. درحين عمل متعادل سازي, كروماتوگرام حاصل بصورت خطي يك دست و ممتد ظاهر مي شود كه اصطلاحاً خط پايه (Baseline) ناميده مي شود.

2-3-2- اِعمال نمونه (Sample Application)

پس از مرحلة متعادل سازي بستر ستون كروماتوگرافي، نمونة بيولوژيك محتوي پروتئين بصورت يك جريان محلول از طريق پمپ وارد ستون كروماتوگرافي مي شود كه اين مرحله در اصطلاح مرحلة "اعمال نمونه" ناميده مي شود. اين مرحله در روشهاي كروماتوگرافي جذبي، مرحله جذب (adsorption) هم ناميده مي شود, زيرا فرض براين است كه پروتئين مورد نظر به رزين كروماتوگرافي جذب مي شود.

2-3-3- شستشوي رزين كروماتوگرافي (Washing)

پس از مرحلة وارد كردن نمونة پروتئين به داخل فاز ثابت يا بستركروماتوگرافي، لازم است كه بستر كروماتوگرافي با بافر مشابه بافر متعادل سازي با يك يا دو برابر حجم ستون كروماتوگرافي شسته شود تا ذرات و ناخالصي هايي كه بصورت غير ويژه به رزين كروماتوگرافي چسبيده اند از ستون خارج شوند و شرايط براي خروج و جداسازي پروتئين مورد نظر از بقية  ناخالصي ها با استفاده از يك بافر ويژه ايجاد گردد. لازم به يادآوري است كه در روش فيلتراسيون ژلي (Gel Filtration) كه مكانيزم جداسازي جذبي نبوده و براساس پديدة نفوذ براساس اندازة مولكولي ( مراجعه شود به فصل 4 بحث فيلتراسيون ژلي ) انجام
مي گيرد، مرحله شستشو در واقع همان مرحلة خارج سازي پروتئين مورد نظر بوده و نيازي به مرحلة بعدي يعني مرحلة دفع (Desorption) نيست و دراين روش بافر شستشو بدون هيچ تغييري عيناً شبيه بافر مرحلة تعادل سازي است و در واقع برای کروماتوگرافي فقط از يك بافر استفاده مي شود . به همين دليل اين نوع كروماتوگرافي داراي شرايط Isocratic مي باشد يعني بافر هيچگونه واكنشي با ماتريس ندارد. اين درحالي است كه در روشهاي جذبي ممكن است كه بافر مرحلة شستشو ، فقط مقداري از خصوصيات بافر مخصوص مرحلة دفع را دارا باشد.

2-3-4- خارج سازي (Elution) يا مرحله دفع (Desorption)

 عمل خارج سازي به مرحله اي گفته مي شود كه پروتئين مورد نظر كه قبلاً به رزين كروماتوگرافي براساس مكانيزم ويژه جذب چسبيده است، با استفاده از وارد كردن يك بافر بخصوص از طريق پمپ با ستون كروماتوگرافي از رزين جداشده و از ستون خارج گردد. مكانيزم خارج سازي يا دفع پروتئين از ستون كروماتوگرافي براساس ايجاد شرايطي است كه عكس مكانيزم جذب عمل مي كند و در مورد هركدام از روشهاي كروماتوگرافي در فصول بعد مورد بحث و بررسي قرار خواهد گرفت.

2-3-5- بازيابي (Regeneration)

رزينهاي كروماتوگرافي بعد از هر بار استفاده نياز به شرايطي دارند كه تمامي ناخالصي و ذراتي كه بصورت ويژه يا غيرويژه به ستون چسبيده اند از ستون خارج گردند تا درمرحله بعد بتوانند مورد استفاده مجدد قرار بگيرند. لذا بعد از هرمرحله كروماتوگرافي عمل شستشوي بستركروماتوگرافي با استفاده از يك محلول, كه داراي شرايطي است كه هرگونه جذب ميان ذرات موجود در ستون با رزين را خاتمه مي دهد، انجام مي پذيرد. لازم به ذكر است كه بازيابي هر ستون كروماتوگرافي بسته به نوع رزين و روش كروماتوگرافي نيازمند محلولی ويژه است و در شرايط عملياتي خاصي كه از طرف كمپاني سازنده رزين پيشنهاد مي گردد انجام مي شود. درمواردی نيز شركت سازندة رزين كروماتوگرافي بازيابي بعد از هر مرحله كروماتوگرافي را پيشنهاد نمي کند.

2-3-6- تميزكردن درمحل (Cleaning-In-Place)

در مواقعي عمل بازيابي (Regeneration) جهت خارج كردن تمام ذرات موجود در ستون كافي نيست و لازم است كه ستون كروماتوگرافي با يك محلول قوي تر شستشو شود, زيرا اين ذرات با سدكردنِ خروج جريان از ستون، افزايش فشار مقاوم و كاهش دبي جريان درحين كروماتوگرافي باعث افزايش هزينه هاي عملياتي خواهند شد. لذا «تميز کردن در محل» بسيارمهم بوده و در مورد هر ستون كروماتوگرافي با توجه به نوع ناخالصي هاي موجود از محلول خاصي استفاده مي شود. معمولاً محلول NaOH  به عنوان محلول مناسبي توصيه مي شود.

2-3-7- سترون كردن (Sanitization)

 سترون كردن  عبارتست از غيرفعال كردن رشد ميكروبي در بستر ستون كروماتوگرافي بعد از هر عمل كروماتوگرافي كه براي اين كار بايد ستون كروماتوگرافي با استفاده از يك محلول, كه بعنوان عامل
سترون سازي شناخته مي شود، شسته شود. معمولاً محلول (0.2-0.5M) NaOH درمورد بسياري از ستونهاي كروماتوگرافي بعنوان يك عامل سترون سازي استفاده مي شود.

2-3-8- نگهداري (Storage)

رزين كروماتوگرافي همواره بايد در شرايطي نگهداري شود كه از رشد باكتري در بستر ستون جلوگيري شده تا اينكه بعداً بر روي عمل جذب تأثير نگذاشته و موادي مانند اندوتوكسين ها خواص كروماتوگرافي را تحت تأثير قرار ندهند. جهت نگهداري رزين همواره از يك عامل ضد باكتري استفاده مي شود كه طيف وسيعي را دربر مي گيرند مانند هيدروكسيد سديم 0.01M NaOH و محلول اتانول 20% و يا محلول سديم آزيد
0.02%-0.05% Sodium Azide . عمل نگهداري همواره در حضور اين عوامل انجام مي شود.

ادامه...

 

فهرست مطالب...

يادداشت برداريد...

تقويم...

بحث در مورد اين درس...

نظرخودرا منعكس كنيد...

نامه الكترونيكي به سايرين...

خروج از كارگاه...

If you have problem to view this page in Farsi please download these fonts: Mitra    Lotus   Titr in your directory of windows\fonts

or adjust Enconig of your explorer (from View menu) to unicode UTF-8