نسخه قابل چاپ درس 1 (فصل 1و2 )

2-4- پارامترهاي عمليات واحدي

عمليات واحد(Unit Operation)  در هر روش جداسازي کروماتوگرافي تحت تأثير عوامل متفاوتي قرار دارند که در اين قسمت به آنها مي پردازيم.

2-4-1- بازماندن Retention

از زمان وارد كردن نمونه تا ظهور اولين جزء بصورت يك پيك، حجمي از بافر كه از ستون مي گذرد به "حجم بازماندن(V_r)" موسوم است. بيشترمواقع به جاي حجم بازماندن از  زمان بازماندن(t_r)استفاده مي شود، چون
اندازه گيري آن ساده تر است. زمان بازماندن فاصله زماني مابين تزريق نمونه تا رسيدنِ حداكثر ارتفاع پيك اولين جزءآن به آشكارساز است(شكل 2-2). به هر حال اين دو پارامتر كاملا" با يكديگر مرتبط هستند:

 (معادله2-1)                                                    V_r=F_c.t_r 

كه F_c سرعت جريان حجمي( معمولا" بر حسب ml/min)  حركت بافر است.

پيك كوچكي كه معمولا" در ابتداي سمت چپ كروماتوگرام ديده مي شود (در آزمايشگاه معمولا" front يا solvent front خوانده مي شوند) مربوط به اجزائي است كه در ستون باز نمي مانند. بطور طبيعي نمونه و يا فاز متحرك حاوي اجزايي اين چنين است كه بدون هيچ تأخيري از ستون گذر مي كنند. زماني كه طول مي كشد تا اين اجزأ به آشكارساز برسند به زمان مرده t_m موسوم است(شكل2-2) و حجمی از فاز مايع که در اين زمان مصرف ميشود حجم خالي (Void volume) ناميده مي شود. سرعت مهاجرت اين اجزأ برابر با سرعت حركت مولكولهاي فاز متحرك است. تغيير در t_m  مي تواند در اثر تغيير در سرعت جريان به خاطر عملكرد پمپ ها, نشتي, تغيير در ابعاد ستون, ويا دانسيته فاز ثابت پر شده در ستون باشد.

2-4-2- ظرفيت (Capacity)

نسبت تعداد مولكولهاي يك جزء در فاز ثابت به تعداد مولكولها در فاز متحرك ( N_s / N_m  ) به ظرفيت k' موسوم است. ظرفيت همچنيني معياري است براي مدت زماني كه مولكول يك جزء در فاز ثابت صرف ميكند به نسبت مدتي كه در فاز متحرك قرار دارد . بدين ترتيب عامل ظرفيت با زمان بازماندن يك جزء ارتباط دارد :

(معادله2-2)                                            k' =(t_r –t_m)/ t_m       

كه در آن t_r زمان شستشوي جزء بازمانده، و t_m زمان شستشوي جزء آزاد است.  t_r وt_m  به سهولت از روي كروماتوگرام قابل اندازه گيري هستند. شدت k'  تحت تأثير خصوصيات فيزيكي و شيميايي جزء جداشونده و فازهاي ثابت و متحرك و نيز درجه حرارت ستون است. با افزودن نسبت فاز ثابت به فاز متحرك مي توان بازماندن جزء در ستون را افزايش داد. تغيير در k' نشانگر صدمه ديدن فاز ثابت است. از آنجا كه شدت k' متناسب با مدت زمان بازماندن يك جزء در داخل ستون است، اندازه عددي k' نمايانگر سرعت شستشوي آن جزء خواهد بود.

ظرفيت يك رزين كروماتوگرافي مقياسي كمّي از توانايي رزين نسبت به جذب عامل جذب شدني ( در اينجا پروتئين ) براساس ميزان گروه هاي عاملي است كه عمل جذب را انجام مي دهند و اهميت زيادي در روشهاي كروماتوگرافي جذبي دارد. فاكتور ظرفيت به عواملي از قبيل خواص پروتئين ( از نظر اندازه و ويژگي هاي جذبي در شرايط تجربي دما و pH )، خواص ساختاري رزين كروماتوگرافي ( تعداد گروه هاي عاملي كه عمل جذب را انجام مي دهند بر روي شبكه جامد، اندازه رزين و ميزان تخلخل هاي درون ساختار رزين ) و نهايتاً شرايط عملي نظير pH، دما و قدرت يوني بستگي دارد.

در عمل براي تعيين مقدار رزين کروماتوگرافي و حجم بستر کروماتوگرافي جهت تخليص يک مقدار مشخص از نمونة مورد نظر از فاکتوري به نام ظرفيت پيوندي(Banding capacity) يا ظرفيت جذب
( Adsorption capacity) که مشخص کنندة مقدار پروتئين قابل جذب به حجم مشخصي از رزين کروماتوگرافي است, استفاده مي کنند.

2-4-3- بازدهي (Efficiency)

شكل مطلوب گذر تركيبات از خلال ستون بصورت نوارهاي خيلي باريك است. اما در عمل نوارها عريض و پخش مي شوند. اين وضعيت ناشي از انتشار و جريان ناهمگون فاز مايع از خلال ذرات پايه است.
در كروماتوگرافي ستوني تعريض نوار منجر به ايجاد پيكهاي عريض ترمي گردد. مي توان پديده تعريض نوار را به اين صورت شرح داد كه اگر دو مولكول مشابه در يك زمان در بالاي ستون قرار گيرند، الزاما" همزمان به انتهاي ستون نمي رسند. از آنجا كه تمام شرايط براي هر دو مولكول يكسان است، اين پديده بايد مربوط به ديناميك جريان فاز متحرك و ژئومتري ستون باشد. در كروماتوگرافي، بستر يا ستوني از ذرات فاز ثابت كه گسترش نوارهاي اجزاء را به حداقل برساند داراي بازدهي بالا هستند.

ضريب بازدهي (N) درواقع ميزان گسترش منطقه اي نمودار خروج پروتئين از ستون كروماتوگرافي
( پهناي پيك ) است كه بصورت رابطه زير نمايش داده مي شود :

معادله 2-3    

در اينجا V₁ حجم شستشو براي پيك شماره 1 (شکل 2-3) و W_1/2 ميزان پهناي همان پيك در نصف ارتفاع پيك است. عدد N از نظر عمليات واحدي به عنوان تعداد صفحات در فرايند جداسازي مطرح است. تعداد صفحات تئوري در واقع بدين معني است كه در ستون, جداسازي ذرات براساس مكانيزم انتقال جرم در يك صفحه انجام مي گيرد و فرض بر اين است كه تمام طول ستون كروماتوگرافي مجموعه اي از اين صفحات هستند كه عمل جداسازي را براساس پديدة نفوذ و انتقال جرم انجام مي دهند. هرچه تعداد اين صفحات, يعني محلهايي كه عمل جداسازي بين ذرات مختلف انجام مي شود، بيشتر باشد بازدهي فرايند جداسازي بيشتر است. به همين منظور فاكتور HETP ( ارتفاع معادل با يك صفحه تئوري ) بصورت زير مطرح مي شود:

معادله 2-4        HETP=L/N                                                                      كه در اينجا L معرف طول ستون و N تعداد صفحات تئوري مي باشد . محاسبه هركدام از فاكتورهاي HETP ويا N براي محاسبه بازدهي كافي است. با توجه به اينكه تعداد صفحات تئوري (N) و HETP بصورت كاملاً تخصصي يك بحث مهندسي شيمي از نوع عمليات واحدی مي باشد خوانندگان گرامي مي توانند جهت اطلاعات بيشتر به منابع معرفي شده در پايان فصل مراجعه نمايند.

فاكتور N به شرايط عملي نظير دبي جريان (Flow rate) و ميزان اِعمال نمونه (Sample loading) بستگي دارد و توسط پديده نفوذ كنترل مي شود. لذا گرچه بازدهي در مورد تمام روشهاي كروماتوگرافي مطرح بوده و روشهاي خاص اندازه گيري بازدهي براي اين روشها وجود دارد ولي اين روش در مورد كروماتوگرافي فيلتراسيون ژلي كه قوياً توسط مكانيزم انتقال جرم كنترل مي شود، اهميت بيشتري از ساير پارامترها نظير انتخابگري و ظرفيت دارد.

2-4-4- انتخابگري (Selectivity)

انتخابگري ( كه بصورت α نمايش داده مي شود ) عبارت است از توانايي يك سيستم كروماتوگرافي براي جداكردن پيكهاي مربوط به كروماتوگرام.

با استفاده از شكل 2-3  ابتدا ضريب ظرفيت را براي پيك 1 بصورت زير تعريف مي كنيم :

(معادله 2-5)      

بنابراين با دردست داشتن ظرايب ظرفيت براي پيكهاي شماره 1و2 طبق معادله 2-5، ميزان انتخابگري را بصورت زير تعريف مي كنيم:

(معادله 2-6)          

بدين ترتيب انتخابگري به عنوان نسبت حجم خارج سازي (Elution Volume) براي دو پيك جداگرانه مطرح مي گردد. انتخابگري معمولاً در مورد كروماتوگرافي هاي جذبي مطرح است و به عواملي از قبيل نوع و تعداد گروه هاي عاملي در روش كروماتوگرافي مذكوردر شرايط عملي نظير pH و قدرت يوني بستگي دارد.

2-4-5- قدرت جداسازي (Resolution)

قدرت جداسازي در واقع يك اندازه گيري از جداسازي نسبي دو پيك بر روي كروماتوگرام مي باشد كه به سه پارامتر انتخابگري، بازدهي و ظرفيت به صورت رابطه (2-7 ) ارتباط دارد. بنابراين لازم است كه پروسه تخليص به نحوي بهينه گردد كه فاكتورهاي انتخابگري، بازدهي و ظرفيت در جهت افزايش ميزان جداسازي بهينه گردند.

معادله 2-7

فاكتور انتخابگري، α-1/ α ، معمولا" مهمترين فاكتور است. براي مثال افزايشي در α از 01_/1 به 02_/1 (يعني فقط1%) سبب دو برابر شدن قدرت جداسازي مي شود. اگر αبرابر1 باشد امكان جداسازي وجود نخواهد داشت. افزايش فاكتور ظرفيت يا بازماندن، k'/ (k'+1) ، باعث افزايش قدرت جداسازي مي شود، اما زماني كه k' بيشتر از 5 شود افزايش بسيار ناچيز خواهد بود و فقط باعث كاهش سرعت جداسازي خواهد شد. سر انجام افزايش در تعدادصفحات فرضي ( مثلا" با استفاده از ستوني بلندتر) باعث افزايش قدرت جداسازي مي شود. به هر حال افزايش چهار برابر در طول ستون براي دو برابر شدن قدرت جداسازي مورد نياز است.

در صورت برخورد با مشكل قدرت جداسازي ناكافي كارآمدترين راه حل تغيير شرايط كروماتوگرافي با هدف بازماندن نسبي بيشتر است. تغيير در pH و يا در ساختار فاز متحرك متداولترين راه براي افزايش α است. افزايش طول ستون به تنهايي ناكارآمد است و موجب افزايش قابل ملاحظه مدت جداسازي خواهد شد.

اگر مشكل بر عكس اين باشد و نياز به سرعت بخشيدن جداسازي باشد استفاده از ستونهاي كوتاهتر بهترين راه حل است،كه در اينجا استفاده از بازماندن نسبي بيشتر سودمند است چرا كه امكان استفاده از ستونهاي كوتاه تر و سريعتر را بوجود مي آورد. ( بحث در فصول بعدي ) .

بديهي است كه واحدهاي اندازه گيري حجم هاي خارج سازي (V1,V2) بايد با واحدهاي اندازه گيري پهناي پيك (W1,W2) يكسان باشد

 

فهرست مطالب...

يادداشت برداريد...

تقويم...

بحث در مورد اين درس...

نظرخودرا منعكس كنيد...

نامه الكترونيكي به سايرين...

خروج از كارگاه...

If you have problem to view this page in Farsi please download these fonts: Mitra    Lotus   Titr in your directory of windows\fonts

or adjust Enconig of your explorer (from View menu) to unicode UTF-8