نسخه قابل چاپ درس 2 (فصل 3)

3-3- عمليات پيش‌پالايش محصولات برون سلولي

وقتي محصولات برون سلولي مورد بحث قرار مي‌گيرند در واقع منظور حالتي است كه پروتئين خارج از سيستم توليد كنندة سلولي قرار دارد و معمولا" با غلظت کمي از پروتئين در داخل يك محلولِ با حجم بالا سروكار داريم. لذا دراين مورد ابتدا بايد سلولهاي موجود در محلول حذف شده وسپس در مرحلة بعد جهت تغليظ محلول محتوي پروتئين حجم محلول توسط روشهاي مناسب كاهش داده شود. اين مراحل همانطور كه در شكل 3ـ1 نمايش داده شده است به ترتيب جداسازي مواد و ذرات جامد و كاهش حجم نامگذاري شده‌اند كه در اينجا مورد بحث قرار مي‌گيرند.

3-3-1- جداسازي سلولي

بهترين روشها جهت جداسازي سلولها از محلول محتوي پروتئين استفاده از سيستم‌هاي سانتريفوژ پيوسته و روش فيلتراسيون با جريان متقاطع (Cross-flow-filtration) مي‌باشند.

3-3-1-1- سانتريفوژ

بطور كلي روش سانتريفوژ عبارتست از جداسازي جامد از مابع تحت تأثير نيروي گريز از مركز براساس اختلاف دانيتة وزني آنها. سانتريفوژها انواع مختلفي دارد كه در سه مقياس پيوسته   flow thorough Centrifuge) و يا (Contionus، سانتريفوژ با مقياس نيمه صنعتي (Pilot-Scale Centrifuges) و سانتريفوژهاي آزمايشگاهي Fixed Volume Centrifuges) و يا (Laboratory Centrifuges )تقسيم‌بندي مي‌گردد. جهت جداسازي سلولها باتوجه به حجم بالا, استفاده از سانتريفوژ پيوسته پيشنهاد مي‌گردد كه در سه صورت ديسكي (Stacked disks in bowls)، چمبر (Concentric Chamber) و سيلندر (long Cylinder or tube) تقسيم‌بندي مي‌شوند. بهرحال با استفاده از سانتريفوژ بازدهي جداسازي سلولها بسيار بالا بوده ولي هزينة اين دستگاهها مخصوصا" در مقياسهاي بالاي توليدي بسيار بالا است.

شكل 3ـ2ـ بصورت تصويري مكانيزم جداسازي در سيستم‌هاي سانتريفوژ پيوسته را در سه نمونه متفاوت آن نشان مي‌دهد.

شكل 3ـ2ـ طراحي‌هاي مختلف براي سانتريفوژ پيوسته  ديسكي  لوله‌اي و  چمبر

3-3-1-2- ميكروفيلتراسيون به روش فيلتراسيون با جريان متقاطع:

 عمل فيلتراسيون از روشهاي ديگري است كه جهت جداسازي ذرات جامد از محيط مايع مورد استفاده قرار مي‌گيرد و از طريق عبور دادن جريان محلول محتوي ذرات جامد از يك محيط واسطه (كه بصورت‌هاي مختلف غشاء و يا محيط متخلخل مي‌تواند باشد) تحت فشار عمل جداسازي را انجام مي‌دهد. فيلتراسيون انواع مختلف دارد كه از جملة آنها روشهاي اولترافيلتراسيون و ميكروفيلتراسيون و يا فيلتراسيون معمولي مي‌باشند و تفاوت آنها در اندازة حفره‌ها يا تخلخل‌هاي موجود برروي محيط جداسازي و اندازة ذرات قابل جداسازي است. در فيلتراسيون با جريان متقاطع يا عمودي, مايع بر روي فيلتر پمپ مي‌شود.

شكل 3ـ3ـ بصورت شماتيك يك سيستم فيلتراسيون با جريان متقاطع را نشان مي‌دهد.

شكل 3ـ3ـ فيلتراسيون با جريان متقاطع

استفاده از روش فيلتراسيون براي جداسازي باكتريها كه امكان جداسازي آنها از طريق سانتريفوژ بدليل اختلاف كم دانسيتة اين ذرات با محيط مايع وجود ندارد، توصيه مي‌شود. به هرحال روش فيلتراسيون هم داراي معايبي از قبيل امكان ايجاد مقاومت در مقابل عمل فيلتراسيون از طريق گرفتگي فيلتر توسط ذراتي كه بر روي آن جمع مي‌شوند, است. بعضي مواقع برای جداسازي سلولها, تركيبي از هردو روش سانتريفوژ و فيلتراسيون پيشنهاد مي‌گردد.

3-3-2- كاهش حجم

مرحلة بعد از جداسازي سلولها در مورد محصولات برون سلولي كاهش حجم مي‌باشد. باتوجه به اينكه غلظت پروتئين در داخل محلول مخصوصا" در مورد سيستم‌هاي توليد كنندة پروتئيني ترشحي (مانند سلولهاي پستانداران) پائين است، بايد براي کاهش زمان جداسازي توسط کروماتوگرافي, حجم محلول محتوي محصول پروتئيني را كم كرده و آن را تغليظ نمود. به اين منظور از روشهاي مختلفي نظير اولترافيلتراسيون, روشهاي جذب, و عمل رسوبدهي (Precipitation) استفاده مي‌گردد كه در اينجا اختصارا" به هركدام از اين روشها مي‌پردازيم.

3-3-2-1- اولترافيلتراسيون

مكانيزم عمل در اين روش با مكانيزم روش ميكروفيلتراسيون يكسان بوده و تنها تفاوت در اندازة ذرات جداشدني و محيط جداكننده است. معمولا"در اولترافيلتراسيون براي تغليظ,  محصول پروتئيني از نمك و مواد آلوده كننده ديگر با استفاده از يك محيط جدا كننده, كه به صورت غشاء يا بسترهاي فيبري متخلخل (Hollow Fiber Cartridge
 موجود است، جدا مي شود.

اندازة منافذ (كه اصطلاحا" Cut-Off ناميده مي‌شود) باتوجه به اندازة محصول پروتئيني و كوچكتر از آن انتخاب ميگردد و دامنه 1000 تا 100000 دالتون را در بر ميگيرد.

 شكل 3ـ4 نمونة يك سيستم اولترافيلتراسيون را كه با استفاده از فشار گاز خنثي بر روي محلول محتوي پروتئين از بالا عمل كرده و باعث عبور ذرات زير Cut-Off   غشاء كه در قسمت ته ظرف نصب گرديده است، عمل تغليظ را انجام مي‌دهد.

شكل 3ـ4ـ سيستم اولترافيلتراسيون Stirred – Cell با استفاده از غشاء متخلخل

3-3-2-2- روشهاي جذب

باتوجه به اينكه روشهاي كروماتوگرافي جذبي نظير كروماتوگرافي به روش تعويض يون
(Ion Exchange Chromatography)  و كروماتوگرافي با استفاده از جاذبة هيدروفوبيك
(Hydrophobic Interaction Chromatography) توانايي جذب محصول و در نتيجه تغليظ محلول محتوي پروتئين موردنظر را دارند، ، لذا مي‌توان با استفاده از انتخاب رزين مناسب باتوجه به آنچه در فصل 4 در مورد مكانيزم و نحوة استفاده از روشهاي كروماتوگرافي ارايه خواهد گرديد فاز محلول محتوي پروتئين را به هركدام از اين روشها معرفي نموده و ضمن تغليظ پروتئين يك جداسازي نسبي را هم انجام داد. در اين روش نكتة مهم استفاده دبي (Flow rate) بالا بسيار حايز اهميت مي‌باشد تا بتواند زمان انجام پروسة را كم كرده و فعاليت پروتئازها را نيز به حداقل مقدار ممكن برساند.

3-3-2-2- رسوب‌دهي

يكي از مهم‌ترين تكنيكها جهت كاهش حجم و تغليظ محصول پروتئيني استفاده از روشها مختلف رسوب دهي مي‌باشد كه به طرق مختلف از قبيل رسوب‌دهي بوسيلة نمك، حلالهاي آلي حلالهاي پليمري اين عمل مي‌تواند انجام پذيرد و شناخته

شده‌ترين روش براي انجام عمل رسوبدهي استفاده از نمك است كه با افزايش مقدار نمك حلاليت پروتئيني كم شده و در نتيجه عمل رسوبدهي يا Salting –out انجام مي‌پذيرد. سري هوف ميستر  قدرت رسوبدهي نمك‌ها را به‌صورت ذرات آنيوني و كاتيون بصورت آراية زير نشان مي‌دهد:  

Anions: Po4^3-, So4 ^2-, CH3Coo ^-, Cl ^-, Br ^-, No₃ ^-, Clo₃ ^-, I ^-, SCN ^- 

Cations: NH4⁺, K⁺, Na⁺, gunidine Cl(CH2)₃⁺

نمكهايي مانند آمونيوم فسفات و آمونيوم سولفات كه در سمت چپ اراية فوق قرار           مي‌گيرند اصطلاحا" به(Anti-Chaotropic)
آنتي كائوتروپيك    موسومند كه از معروفترين نمكهاي عامل Salting-Out  هستند.

 مكانيزم عمل آنها از طريق هيدراته كردن ذرات نمك افزوده شده و در نتيجه دور كردن مولكولهاي آب از سطوح هيدروفوب  پروتئين‌ها است, درنتيجه اين سطوح هيدروفوب به هم پيوسته و رسوب مي‌دهند.

در رسوبدهي توسط حلال آلي با افزايش حلال‌ آلي، قدرت حلاليت مولكولهاي باردار آب دوست پروتئيني در محيط آبي كم شده و باعث بهم پيوستن ذرات مولكولي و رسوبدهي آنها مي‌شود. در واقع اين مكانيزم بسيار شبيه مكانيزم رسوبدهي پروتئينها در نقطة ايزوالكتريك(Iso-electric Point) در غلظتهاي پايين نمك است. معروفترين حلال آلي اتانل است, كه در جداسازي اجزاء پروتئينهاي پلاسمايي بسيار مورد استفاده قرار مي‌گيرد.

استفاده از پليمرهاي آلي (Organic Polymers) براي افزايش رسوبدهي ذرات پروتئيني نيز يكي ديگر از روشهاي بسيار معمول رسوب‌دهي است. مكانيزم رسوبدهي توسط اين مواد شبيه استفاده از حلال‌ آلي و از طريق كاهش فعاليت محيط آبي است. معروفترين ماده اي كه در اين دسته قرار دارد و استفاده از آن بسيار مرسوم است Poly Ethylen Glycol است كه با وزن مولكولي بالاي 4000 بخصوص در مورد پروتئين هاي پلاسمائي بسيار موثر است.  

(اولين پروتئين پلاسمايي كه توسط PEG رسوب داده شده فيبرينوژن است).به هر حال استفاده از مواد پليمري آلي داراي اين عيب است که محلول آنها داراي ويُکوزسکوزيته بالا بوده و عملا" استفاده از اين مواد را جز در مورد PEG  غيرممكن مي‌سازد.

جدول 3ـ1ـ برخي از عوامل رسوبدهي را با ذكر نوع و خواص آن بصورت خلاصه ارائه مي کند.

بهرحال آنچه كه در مورد استفاده از روشهاي رسوبدهي بخصوص در مقياس‌هاي صنعتي قابل ذكر است عدم بازدهي بالاي اين روشها مي‌باشد زيرا اولا" استفاده از عوامل نمكي يا آلي هزينه‌هاي زيادي را  از نظر قيمت مواد در مقياس‌هاي صنعتي در بر دارد و ثانيا" مسئله بسيار مهم ايجاد مشكلات دفع ضايعات يا فاضلاب در صورت استفاده از اين مواد در يك مقياس صنعتي مي‌باشد.

ادامه...

 

فهرست مطالب...

يادداشت برداريد...

تقويم...

بحث در مورد اين درس...

نظرخودرا منعكس كنيد...

نامه الكترونيكي به سايرين...

خروج از كارگاه...

If you have problem to view this page in Farsi please download these fonts: Mitra    Lotus   Titr in your directory of windows\fonts

or adjust Enconig of your explorer (from View menu) to unicode UTF-8