3-4

باتوجه به اينكه در محصولات پروتئيني كه در داخل سلول توليد مي‌شوند مسئله اصلي ابتدا جمع‌آوري سلول محتوي پروتئين است. بنابراين در اولين مرحله عمل دروكردن سلول (Cell Harvesting) انجام پذيرفته و بعد از انجام عمل شكست سلولي با اطلاع از محلول يا غير محلول بودن پروتئين موردنظر عمليات پيش‌پالايش با روشهاي مناسبي كه در اينجا معرفي مي‌گردند, ادامه مي‌يابد.

گرچه هردو روش استفاده از سانتريفوژ و ميكروفيلتراسيون مي‌توانند براي جمع‌آوري سلول‌هاي محتوي پروتئين قابل استفاده ‌باشند, اما باتوجه به اينكه در استفاده از روش فيلتراسيون با جريان متقاطع، دبي جريان به مرور و پس از جمع‌آوري

30% كل ذرات سلولي كاهش مي‌يابد و بازدهي اين روش پايين مي‌آيد, استفاده از عمل سانتريفوژ توصيه مي شود. بهرحال نوع سيستم سانتريفوژ به مقياس فرايند بستگي دارد كه باتوجه به حجم محلول بيولوژيك بعد از عمليات تخمير انتخاب مي‌گردد. استفاده از سيستم‌هاي سانتريفوژ پيوسته داراي بازدهي بسيار بالا بوده اما سبب افزايش هزينه‌هاي ثابت خواهد شد.

3-4-2- شكست سلولي

بعد از جمع‌آوري سلولهاي محتوي پروتئين، اولين مرحله شكستن و درهم ريختن ديوارة سلولي و خارج كردن پروتئين از داخل سلول است. اين عمليات عمدتا" به دو روش انجام مي‌پذيرد: روشهاي مكانيكي و روشهاي غيرمكانيكي.

3-4-2-1- روشهاي مكانيكي

سه روش عمدة مكانيكي جهت شكست سلولها عبارتند از: wet milling، High Pressure Homogenizor و روش Ultrasound، البته باتوجه به پيشرفت تكنولوژي روشهاي ديگري نيز وجود دارند كه عمومي نبوده و لذا از ذكر آنها در اينجا خودداري مي‌كنيم.در روش wet milling در واقع اساس كار استفاده از دانه‌هاي شيشه‌اي مي‌باشد كه با استفاده از يك سيستم محوري هم‌زن در داخل يك محفظه همانند چرخ گوشت, دانه‌ها هم زده و به سمت جلو رانده مي شوند و نمونة بيولوژيك كه از ابتدا وارد اين محفظه شده است در فضايي كه دانه‌هاي شيشه‌اي قرار دارند قرار گرفته و در نتيجة ايجاد تنش

) حاصل از حركت دانه‌ها و با انتقال اين تنش به سلول، ديوارة سلولي خرد مي‌شود. فاكتورهاي زيادي در اين روش مؤثر هستند كه به اختصار عبارتند از: سرعت هم‌زن، سرعت ورود نمونة بيولوژيك به داخل محفظه، اندازة دانه‌ها، دانسيتة سلولي، وزن دانه‌ها، دما، طراحي هم‌زن و ساختار هندسي محفظة آسياب.

از طرف ديگر براي ميكروارگانيزم‌هاي مختلف تعداد دفعات ورود و خروج نمونة بيولوژيك به داخل دستگاه بسيار مهم بوده و بايد بهينه شود. اين دستگاهها در مقياس‌هاي متفاوت آزمايشگاهي، نيمه صنعتي و صنعتي بوده و لذا هركدام طراحي خاص خود را دارند. از جمله مزيت‌هاي اين دستگاه قابليت استفادة آن براي تمام انواع ميكروارگانيزم‌ها مي‌باشد. اما از معايب آن وجود متغيرهاي كنترلي زياد و هزينه‌هاي طراحي و تلفات دانه‌هاي شيشه‌اي در پروسه‌هاي متوالي مي‌باشد.

از ديگر روشهاي بسيار موفق در شكست سلولي, استفاده از سيستم High Pressure Homagonizor است. اين سيستم‌ها از دو قسمت اصلي تشكيل شده‌اند:

الف) قسمت پمپ پيستون كه ايجاد كننده يك فشار بالا است. ب) شير كنترل كه كار كنترل و تنظيم فشار را در دستگاه انجام مي‌دهد.

اساس كار در اين دستگاه به اين ترتيب است كه ابتدا نمونة بيولوژيك از طريق يك قيف و بصورت خودكار به داخل سيلندر دستگاه مكش مي‌ددشود

(مانند سيستم
High Pressure Homagenizer / شركت Niro-Suavia, Italy، كه در شكل 3ـ5ـ نشان داده شده است)

و يا بصورت دستي در داخل سيلندر قرار مي‌گيرد (مانند سيستم French-Press) و سپس با قرار گرفتن پيستون بر روي نمونة بيولوژيك، جريان مايع از طريق يك سوراخ ريز كه در انتهاي سيلندر قرار دارد با فشار به طرف نازل خروجي هدايت مي‌شود كه در اين قسمت شير كنترل عمل كرده و با اعمال يك فشار بالا سلولها از دو طرف نازل خارج شده و ضمن برخورد با ديواره نازل و يكديگر عمل شكست انجام مي‌پذيرد. البته باتوجه به وجود اختلاف فشار شديد در قبل و بعد از خروج از سيلندر, اختلاف دماي محسوسي در حين خروج نمونه ايجاد شده و در واقع دماي خروجي بالا مي‌رود. لذا كنترل افزايش دما مخصوصا" در مواردي كه ساختار پروتئيني به دما حساس باشد بسيار مهم است. شكل 3ـ6ـ مكانيزم خروج را با استفاده از دو نوع شير كنترل كه يكي داراي سرپهن و ديگر داراي لبة تيز و چاقويي است, نشان مي‌دهد.

شكل 3ـ6ـ مكانيزم خروج مواد و عمل شير كنترل در دو نوع شير با لبة پهن و لبة تيز

البته استفاده از سيستم High Pressure Homogenzer (HPH) در مورد باکتريهاي کوچک گرم مثبت که داراي ديواره ضخيم هستند, در فشارهای کمتر از 55 Mpa توصيه نمي شود. اما در مورد مخمر و باكتريهاي مانند E.coli استفاده از اين سيستم در شرايط عملكردي متفاوت مرسوم است. به هرحال در اين روش نيز معمولا" بايد نمونة سلولي بيش از يكبار از سيستم عبور داده شود و تعداد اين دوره‌ها بايد بهينه و كنترل شود. مزيت اين سيستم نسبت به روش wet milling تعداد پارامترهاي كمتر قابل كنترل است كه عبارتند از: فشار عملياتي، طراحي قسمت شير كنترل، دانسيتة سلول و دما.

استفاده از روش Ultra sound در مقابل روشهاي Wet milling و HPH به خصوص در مقياسهاي نيمه‌صنعتي و صنعتي مرسوم نبوده و تنها در مقياسهاي آزمايشگاهي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. اساس كار در اين روش ايجاد پالسهاي صوتي با فركانس بسيار بالا و ايجاد تنش در داخل محلول سلولي و انتقال اين تنش‌ها به ديوارة سلولي و درنتيجه شكست آنها مي‌باشد. بهرحال در اين روش زمان ايجاد پالسها و تعداد دفعات ايجاد پالسها در كنترل عمليات شكست سلولي بسيار مهم مي‌باشد. استفاده از اين روش داراي بازدهي داراي بازدهي بالا نبوده و در مورد عمليات توليد كه باهدف افزايش مقياس صنعتي انجام مي‌شود پيشنهاد نمي‌گردد.

3-4-2-2- روشهاي غير مكانيكي

روشهاي غير مكانيكي در واقع روشهايي آزمايشگاهي هستند و باتوجه به كاربرد محدود فقط با اختصار آنها را نام مي‌بريم. بطور كلي دو دسته روش غيرمكانيكي براي انجام شكست سلولي وجود دارد كه عبارتند از روش Lysis و روش Desiccation. در روش Lysis عمل تخريب يا اضمحلال ديوارة سلولي مي‌تواند با استفاده از آنزيم (مانند ليزوزيم)، مادة شيميايي (مانند استفاده از گلايسين ، آنتي بيوتيك‌ها و يا دترجنت‌هاي كاتيوني يا آنيوني) و نهايتا" از طريق تغيير ساختار فيزيكي سلول (مانند استفاده از شوك اسمزي و يا عمل ذوب و انجماد( انجام گردد.

روش Desiccation از طريق روشهاي مختلف خشك‌كني مانند
Air drying، Vaccume drying، Freeze drying و يا Solven drying انجام مي‌شود. به هرحال استفاده از هيچكدام از اين روشها در مورد عملياتهاي شكست سلولي در مقياس نيمه‌صنعتي يا صنعتي و يا عملياتهايي كه در جهت افزايش مقياس انجام مي‌شوند به‌دليل عدم بازدهي بالا پيشنهاد نمي‌گردد و صرفا" جنبة آزمايشگاهي دارند.

3-4-3- جداسازي مواد جامد

باتوجه به اينكه بعد از عمليات شكست سلولي, انبوهي از مواد جامد مانند تكه‌هاي خرد شدة ديوارة سلولي وجود دارد كه بايد جداسازي شوند, روشهايي نظير سانتريفوژ و ميكروفيلتراسيون براي جداسازي ذرات جامد مي‌توانند مورد استفاده قرار گيرند. در اين مرحله مسائلي كه مشكل عمده را ايجاد مي‌كنند افزايش و سيكوزيته و مقدار زياد ذرات كلوئيدي و معلق ريز كه ممكن است جداسازي آنها مشكل باشد و نيز مهمترين مسئله امكان كاهش فعاليت درصورت طولاني بودن زمان عمليات است.

براي رفع برخي از اين مشكلات در برخي موارد, افزودن لخته سازها

سازها (Flacculants) قبل از عمليات شكست سلولي پيشنهاد مي‌گردد. جهت كاهش فعاليت پروتئازها كه مستقيما" فعاليت محصول پروتئيني را پايين مي‌آوردند، افزودن ممانعت كننده‌هاي فعاليت پروتئاز (بعنوان مثال EDTA با غلظت حدود 5mM و يا برخي آنزيم‌ها

نظير phenyl methyl – Sullonyl ploride باغلظت0.5-1mm) در داخل بافر محتوي سلول بيولوژيك پيشنهاد مي شود. يكي از مهم‌ترين مسايل بعد از شكست سلولي امكان دستيابي به پروتئين بصورت غيرمحلول يعني جداسازي آن در فاز جامد بعد از عمل شكست سلولي است. بطوركلي پروتئين‌هايي كه داراي ميزان بيان (توليد در داخل ميكروارگانيزم) بالايي مي‌باشند و عمدتا"داراي پيوندهاي S-S در ساختار دوم خود هستند، بصورت غيرمحلول يا اصطلاحا"
Inclusion bodies در سلول توليد مي‌شوند كه ساختار اصلي خود را از دست داده (Unfolded) و بايد پس از مرحلة شكست سلولي ابتدا توسط عوامل مناسب حل شده (Solubilizing) و سپس طي فرايندي خاص ساختار اوليه خود را مجددا"به‌دست آورند .(Refolding)) بنابراين بعد از مرحلة شكست سلولي و جداسازي فاز جامد و محلول از يكديگر با روشهايي نظير سانتريفوژ ابتدا بايد پروتئين از نظر محلول يا غيرمحلول بودن چك شود. درصورت غيرمحلول بودن پروتئين ابتدا پروتئين با استفاده از عوامل مختلفي مانند دترجنت‌ها (مثل Triton x-100، SDS و يا Tween-80) و يا عوامل Chaotropic (مثل اوره و گوانيدين هيدروكلرايد) بصورت محلول يا Solubilized درآيد. معمولا" اوره
(4-8M) و گوانيدين (4-6M) به‌عنوان موفق‌ترين عوامل حل كنندة پروتئين‌هاي غيرمحلول پيشنهاد مي‌گردندبعد از مرحلة حل كردن پروتئين، مسئله اصلي احياء ساختار اولية پروتئين (Refolding) در كنار فرايند تخليص مي‌باشد. عمليات Refolding در واقع يك تكنولوژي خاص و پيشرفته است كه باتوجه به ساختار هر پروتئين طراحي مي‌شود. روشهاي مختلفي جهت اين عمليات وجود دارد كه عمدتا"براساس مكانيزم اكسيداسيون و احياء عمل مي کنند. عمل احياء مي‌تواند با استفاده از موادي نظير مركاپتواتانل (Mercaptoethanol) و يا (DTT) 1,4- Dithioerythriol انجام پذيرد. و بعد از آن عمل اكسيداسيون از طريق روشهايي نظير ترقيق (Dilution) و يا فيلتراسيون ژلي (Gel Filtration) انجام مي‌پذيرد. البته همانطوري كه گفته شد تكنولوژي

تكنولوژي Refolding بسيار متنوع بوده و در مورد هر پروتئين بصورت خاص عمل مي‌شود. يكي از شناخته شده‌ترين روشهاي Refoldingحذف اوره و يا گوانيدن به‌عنوان عامل حل كننده بعد از عمليات Solubilizing است, كه اين كار مي‌تواند با استفاده از روش فيلتراسيون ژلي يا ترقيق و يا دياليز انجام پذيرد. عمل دياليز در مورد روشهايي كه در جهت نيمه‌صنعتي يا صنعتي شدن انجام مي‌گيرد، توصيه نمي‌گردد. به هرحال باتوجه به اهميت روش Refolding و تكنيكهاي مختلفي كه امروزه براي اين فرايند طراحي شده است، لازم است كه مبحث

Refolding بصورت اختصاصي‌تر دنبال گردد و علاقمندان مي‌توانند جهت دنبال كردن اين بحث به منابع ارائه شده در انتهاي فصل مراجعه نمايند.

در ادامه بحث جداسازي مواد جامد بايد اضافه كرد كه تكنيكهاي ديگري غير از روشهاي سانتريفوژ و ميكروفيلتراسيون (از طريق فيلتراسيون با استفاده از جريان متقاطع) نيز وجود دارند كه از جمله مي‌توان به روش استخراج با استفاده از دو فاز مايع ) و استفاده از جاذبهاي جامد(Solid – adsorbents) اشاره كرد. در روش استخراج مايع – مايع مبناي كار استفاده از دوفاز مايع كه داراي دو پليمر متفاوت مانند دكستران (Dextran) و
پلي اتيلن گلايكول (PEG) و يا يك پليمر و يك نمك (مانند PEG به‌عنوان پليمر و پتاسيم فسفات به‌عنوان نمك) است، به‌نحوي كه اجزاء ديوارة سلولي، نوكلئيك اسيدها و بخشي از پروتئين‌هاي آلاينده در فاز پاييني قرار گرفته (مثلا” در مورد پليمر / نمك، نمك فاز پايين و پليمر فاز بالايي مي‌باشد) و پروتئين موردنظر در فاز بالايي قرار مي‌گيرد. البته در اين روش فاكتوري به نام ضريب جداسازي بسيار مهم است كه حتما" بايد براي پروتئين موردنظر به اندازة كافي بزرگ باشد تا در فاز بالايي (پليمر) قرار گيرد. پس از اين روش استفاده از يك تكنيك اولترافيلتراسيون براي جداسازي پليمر مثلا"

PEG در مورد سيستم نمك / پليمر) توصيه مي‌شود تا اينكه ضمنا" عمل تغليظ محصول را هم انجام دهد.

در روش ديگر استفاده از مواد جاذب نظير رزين‌هاي تبادل يوني با استفاده از يك سيستم هم‌زن يا استفاده از بسترهاي سيال شده

شده (Fluidized bed) مي‌تواند به‌عنوان روش مناسبي جهت جداسازي اوليه مواد جامد و ناخالصي‌هاي عمدة ناشي از شكست سلولي از پروتئين مورد نظر، مورد استفاده قرار گيرند.

3-4-4- آماده‌سازي نمونه قبل از كروماتوگرافي

پس از انجام مراحلي كه در مورد هر دو نوع محصول درون سلولي و برون سلولي در بخشهاي قبلي به اختصار توضيح داده شد، مسئلة عمده آماده كردن نمونه براي انجام اولين مرحلة كروماتوگرافي است. باتوجه به اينكه فاكتورهايي نظير دما، pH، ميزان قدرت يوني (Conductivity)، ويسيكوزيته، مسئلة وجود عوامل تخريب كنندة ساختار سلولي نظير پروتئازها، توليد محصول بصورت غير محلول محلول Inclusion bodies، مقدار بالا چربي‌ها و اسيدهاي نوكلئيك در بازدهي و كارآيي روشهاي كروماتوگرافي تأثير مستقيم دارند. لذا تمامي تلاشها در اين جهت است كه فاكتورهاي فوق كنترل و بصورت قابل قبولي درآيند تا امكان انجام كروماتوگرافي را فراهم كرده و بازدهي "فرايند عمليات پايين دستي" را در كل بالا ببرد. شكي نيست با انجام برخي از روشهايي كه قبلا" ذكر شد مسايلي از قبيل Inclusion bodies از طريق عمليات محلول‌سازي Solubilizing، جداسازي مقدار قابل ملاحظه‌اي از اسيدهاي نوكلئيك و چربي‌ها با استفاده از روشهاي رسوبدهي، استفاده از روشهاي جذب، روشهاي سانتريفوژ، فيلتراسيون و استخراج مايع – مايع و جلوگيري از فعاليت پروتئازها با استفاده از ممانعتت كننده‌هاي پروتئاز تا حدود زيادي قابل حل مي‌باشد. اما فاكتورهايي نظير pH، دما، قدرت يوني و ويسكوزيته باتوجه به روش كروماتوگرافي موردنظر بايد كنترل و تنظيم گردد.

در مواردي كه كنترل دما مورد نياز باشد و پروتئين موردنظر نسبت به دماي بالا حساسيت داشته باشد, استفاده از سيستم اتاق سرد براي انجام فرايند توصيه مي‌گردد. البته در اين مورد بايد ويسكوزيتة محلول محتوي پروتئين پايين باشد تا از ايجاد فشارهاي مقاوم درحين روش كروماتوگرافي جلوگيري شود. براي كنترل و سيكوزيته از روشهايي نظير
رسوب دهي نوكلئيك اسيدها يا افزايش آنزيم DNase جهت تخريب ساختار نوكلئيك اسيدها و يا ترقيق مي‌توان استفاده كرد. در مواردي كه پايداري پروتئين اجازة فعاليت در دماي اتاق را مي‌دهد, اگر مسئله ويسكوزيته مشكل‌زا باشد، كار نكردن در دماي سرد مي‌تواند از بروز مشكلات مربوط به ويسكوزيتة بالا تا حدودي جلوگيري كند.

درصورتي كه پايين بودن قدرت يوني جهت انجام روش كروماتوگرافي موردنظر باشد, مثلا" در روش كروماتوگرافي تعويض يوني, در اين صورت مي‌توان از روشهايي نظير ترقيق و يا فيلتراسيون براي كاهش غلظت نمك و قدرت يوني در محلول محتوي پروتئين موردنظر استفاده كرد. البته درصورت بالا بودن قدرت يوني استفاده از روشهاي كروماتوگرافي كه قابليت كارآيي در اين شرايط را دارند, مانند روش كروماتوگرافي هيدروفوبيك .

pH يكي از مهمترين پارامترهايي است كه در پايداري پروتئين موردنظر و انجام مراحل جداسازي مخصوصا" در روشهاي كروماتوگرافي جذبي بسيار مؤثر است. لذا انتخاب بافر با ‌pH مناسب همواره باتوجه به روش كروماتوگرافي انجام مي‌شود و تنها بايد مسئله پايداري پروتئين را در مورد انتخاب آن رعايت كرد و حتي‌الامكان pH بافر محتوي پروتئين نبايد خيلي نزديك به نقطة ايزوالكتريك (pI) پروتئين باشد تا اينكه از رسوب كردن پروتئين موردنظر در شرايط عملياتي جلوگيري شود

3-5- نتيجه گيري

مرحلة پيش‌پالايش و جداسازي اولية نمونة محتوي پروتئين موردنظر باتوجه به مسايلي نظير حذف نسبي اسيدهاي نوكلئيك، چربي‌ها، قطعات ديواره‌هاي سلولي و ذرات جامد معلق و حل كردن پروتئين‌هاي غيرمحلول

(Solubilizing) بسيار مهم و حساس بوده و از نظر تأثير بر پايداري و فعاليت محصول و نيز بازدهي روشهاي كروماتوگرافي حايز اهميت بسيار بالايي است. همچنين انجام چنين مراحلي باعث افزايش زمان نيمه‌عمر رزينهاي كروماتوگرافي و جلوگيري از كثيف شدن بيش از اندازة آنها در حين عمليات كروماتوگرافي مي‌شود. بدين منظور باتوجه به تقسيم‌بندي انجام شده در مورد دو نوع محصول درون سلولي و بيرون سلولي و ملاحظات مربوط به هرگروه, روشهاي متنوعي جهت جداسازي و دروكردن سلولهاي محتوي پروتئين موردنظر، شكست سلولي، جداسازي ذرات جامد و عوامل ناخواسته مانند قطعات ديوارة سلولي، ليپيدها و اسيدهاي نوكلئيك (در مورد محصولات درون سلولي) كاهش حجم و جداسازي فازهاي محلول محتوي پروتئين موردنظر (در مورد محصولات برون سلولي) معرفي گرديد. بدون شك موفقيت كل فرايند فرايند عمليات پايين دستي تا حدود زيادي به موفقيت روش‌هاي اتخاذ شده در مرحلة پيش‌پالايش پروتئينها دارد.