|
4-3-
كروماتوگرافي به روش تعويض
يون
Ion Exchange Chromatography
يكي
از متداولترين روشهاي كروماتوگرافي در فرايند تخليص بيومولكولها به
طور عام و پروتئينها
بطور
خاص روش كروماتوگرافي تعويض يوني
است.
باتوجه به اينكه در اين روش از خاصيت
عام
پروتئين
ها
يعني توانايي ايجاد جاذبة يوني با يك مادة جاذب باردار با بار مخالف براي
جداسازي پروتئين مورد نظر از ساير
ناخالصيها استفاده ميشود،
اغراقآميز
نيست
اگر اين روش را
قابل اِعمال
در
مورد
فرايند جداسازي تمامي پروتئين ها بدانيم تنها مسئله اي که شايد باعث شود روش
هاي ديگر بر اين روش در يک
فرايند تخليص خاص ترجيح داده شوند،
به مورد خاص آن فرايند
و
در مورد نيازهاي آن از قبيل ميزان خلوص مورد نياز، زمان و بطور كلي مسئلة
بهينهسازي اقتصادي فرايند مربوط
مي شود.
به هرحال اين روش بهعنوان يك روش شناخته شده در مورد تخليص پروتئين ها از جهات
مختلف قابل بررسي
است.
اولين مسئلهاي كه لازم است در اين بحث به آن پرداخته
شود، تقسيمبندي و اراية يك ديد فيزيكی
و شيميايي از مكانيزم انجام كروماتوگرافي به روش تعويض يوني
است.
پس از آن
ويژگيهاي روش باتوجه به پارامترهاي اساسي فرايند تخليص و جايگاه
اين
روش در
"فرايند
عمليات
پايين
دستي"مورد
بررسي قرار ميگيرد. نهايتا"
با ذكر نمونههاي عملي از كاربرد اين روش سعي در اراية يك الگو براي روش تعويض
يوني خواهيم داشت.
4-3-1-
انواع كروماتوگرافي
تعويض يوني با توجه به مكانيزم عمل
در تمام
روشهاي كروماتوگرافي براي جداسازي يك پروتئين خاص، دو فاز ناهمگون وجود دارد:
فاز جامد
و فاز محلول. فاز جامد
همان رزين كروماتوگرافي
است و خواص ويژة خود را براي جداسازي ذرة مورد نظر در فاز محلول دارد. در روش
کروماتوگرافي تعويض يوني فاز جامد از دو قسمت تشکيل
شده
است:
يكي شبكة جامد (عمدتا"
پليمري يا كوپليمري) كه بهعنوان تثبيت كننده عمل ميكند
و
ديگري گروه عاملي
است
كه وظيفة اصلي جذب يوني را بر روي ذرات باردار موجود در محلول انجام داده و خود
بر روي شبكة جامد قبلا"
تثبيت شده است. ساختار شبكة جامد خواصي از قبيل پايداري فيزيكي
و
شيميايي رزين و ميزان نفوذ پذيري ذرات براي دستيابي به گروههاي عاملي را در سطح
واقعي رزين تعيين ميكند. از طرفی
ديگر در تكنولوژي ساخت اين شبكههاي جامد,
اندازه
يا بزرگي
قطعه های پليمری وتخلخلهاي آنها
كنترل و تعيين ميشود كه در فاكتورهايي نظير هزينة عملياتي، ميزان دبي جريان و
فشار مقاوم تأثير اصلي و اساسي دارند.
انواع مختلف
رزينهاي تبادل يوني براساس نوع بار تثبيت شده گروه عاملي و شدت جذب تعيين
ميشود. مكانيزم تبادل يون بر اين اساس استوار است كه ذرات پروتئيني باتوجه به
نقطة ايزوالكتريك (pI)
آنها
وpH
محلول
ميتوانند داراي برآيند
بار مثبت يا برآيند بار منفي باشند و لذا ميتوانند با يونهاي مثبت يا منفي
قابل حركت (يون متحرك) كه قبلا"
در كنار يونهاي تثبيت شده داراي بار مخالف
قرار گرفتهاند، تبادل شوند.
4-3-1-1-
رزين تبادل كاتيون با خاصيت جذب بالا
(Strong Cation Exchanger Resin)
در
اين نوع رزين يون تثبيت شده بر روي پاية جامد داراي بار منفي و يون متحرك داراي
بار مثبت
است.
لذا در شرايطي كه پروتئين
در داخل محلول داراي بار مثبت باشد (يعني pH
محلول
کمتر
از نقطة ايزوالكتريك
پروتئين باشد)، پروتئين
ميتواند
براساس
ميزان
اختلاف نقطة
pI
و pH محلول
باشدت
های
متفاوتي
جذب
رزين شود. بديهي است هرچه اين اختلاف بيشتر باشد، ميزان جذب پروتئين به يون
تثبيت شده نيز بيشتر خواهد بود.
از
معروفترين رزينهاي تبادل كاتيون، رزين
S-Sepharose
ميباشد كه حرف S
مربوط به گروه تثبيت شدة
Methyl
Sulphonate
ميباشد
.
اين
گروه
داراي بار منفي است و توانايي تبادل پروتئين با بار خالص مثبت را دارد. كلمة
Sepharose
مشخص كنندة نام تجارتي ساختار جامدي است كه گروه
S
بر روي آن
تثبيت شده و خود ميتواند بر
اساس اندازه دانه ها و تخلخلها داراي زير گروههاي مختلفي باشد.
(توضيح بيشتر در بحث عملي خواهد آمد).
4-3-1-2-
رزين تبادل كاتيون با خاصيت جذب پائين
(Weak Cation
Exchanger Resin)
مكانيزم تبادل
در اين نوع رزين عينا"
شبيه رزين تبادل كاتيون با خاصيت جذب بالا است، تنها با اين تفاوت كه به دليل
ساختار شيميايي يون تثبيت شده بر روي پاية جامد,
داراي بار منفي ضعيفتري بوده و متعاقبا"
قدرت جذب آن نسبت به يون متحرك يا پروتئين داراي بار مثبت ضعيفتر
است.
رزين CM- Sepharose
از معروفترين رزينهاي تبادل كاتيون با خاصيت تبادلي پائين
است كه
حرف CM مخفف
Carboxy Methyl
و
كلمة Sepharose
هم دوباره نام تجاري مربوط به ساختار جامد ميباشد.
4-3-1-3-
رزين تبادل آنيون
با خاصيت جذب بالا (Strong Anion Exchanger Resin)
همانطور كه از
نام اين نوع رزين پيداست، در اين رزين يون تثبيت شده بر روي شبكة جامد داراي
بار مثبت و يون متحرك پروتئين بايد داراي بار منفي باشد. از معروفترين
رزينهاي تبادل آنيون
با خاصيت جذب بالا ميتوان رزين
Q-Sepharose
را نام برد كه حرف Q
گروه
Quaternary Ammonium و
كلمة
Sepharose
هم ساختار جامد را مشخص ميكند.
4-3-1-4-
رزين تبادل آينون با خاصيت جذب پائيني
(weak Anion Exchanger Resm)
تفاوت اين رزين با رزين تبادل آينون با خاصيت جذب بالا بازهم در قدرت جذب گروه
عاملي نسبت به يون متحرك يا پروتئين داراي بار منفي
است.
رزين
DEAE-Scpharose
از معروفترين رزينهاي تبادل آينون ميباشد. حروف
DEAE
نشان دهندة گروه Diethylminoethyl
ميباشد.
ويژگيهاي
روش تعويض يوني:
كروماتوگرافي به روش تعويض يوني يكي از كاربرديترين تكنيكهايي است كه بهدليل
عدم محدوديت در برابر حجم نمونة اوليه جهت انجام كروماتوگرافي و بالابودن ظرفيت
كاري رزين براي جذب بصورت وسيع استفاده شده و در مقياسهاي توليدي و
Large scale بسيار
كارآيي دارد. از طرف ديگر زمان انجام كروماتوگرافي در اين روش آنچنان محدود
كننده نيست و ميتوان درصورت رعايت پايداري رزين و ميزان فشار مقاوم در حين
كروماتوگرافي با استفاده از دبي بالا مقدار زيادي از نمونه را در زماني
كم تخليص كرد.
يكي
از ويژگيهاي بسيار قابل توجه اين روش قابليت پيشبيني
تكنيك و
عدم وجود
پيچيدگي
هاي
معمول در روشهاي كروماتوگرافي
است.
اين بدين معني است كه باتوجه به مكانيزم تكنيك ميتوان با انتخاب بافر مناسب
باتوجه به نقطة ايزوالكتريك (pI)
موردنظر رزين مناسب را جهت اعمال روش كروماتوگرافي به صورت
تعويض يوني انتخاب
كرده و به خوبي عمليات تخليص را كنترل كرد.
علاوه بر ويژگيهاي فوق امكان استفاده از روش كروماتوگرافي تعويض يوني براي
جداسازي و حذف يكسري از ناخالصيهاي عمده بهويژه اسيدهاي نوكلئيك
(Nucleic Acids)
و اندوتوكسين (Endotoxin)،
از شناختهترين خصوصيات اين روش ميباشد كه استفاده از آن را در اكثر فرايندهاي
تخليص امكان پذير كرده است.
4-3-2-
هدف و انگيزة استفاده از
كروماتوگرافي تعويض يوني در فرايند تخليص
استفاده از كروماتوگرافي به روش تعويض يوني عمدتا"
در دو جهت صورت ميگيرد:
تغليظ نمونه و جداسازي.
4-3-2-1-
تغليظ نمونه در فرايند تخليص
توسط
كروماتوگرافي تعويض يوني:
براي
اين منظورمعمولا"
از
كروماتوگرافي تعويض يوني در ابتداي پروسة تخليص استفاده شده و نقش بسيار مؤثري
را در كاهش حجم نمونة بيولوژيك ايفا ميكند. اين مرحله به عنوان يك
مرحلة
مقدماتي و آمادهسازي عمل كرده و در اينجا رسيدن به خلوص بالا موردنظر نيست و
هدف كاهش حجم نمونه و جداسازي نسبي نمونة
موردنظر
از
ناخالصيهاي ديگر
است.
به همين دليل در اين حالت معمولا"
كروماتوگرافي به روش
تعويض يوني در واقع مرحلة
Capturing
را انجام ميدهد. آنچه كه مهم است استفاده از رزينهاي كروماتوگرافي تعويض يوني
با اندازه و پايداري مناسب براي انجام چنين هدفي است.
4-3-2-2-
جداسازي
توسط
كروماتوگرافي تعويض يوني:
باتوجه به قدرت بالاي روش كروماتوگرافي تعويض يوني براي جداسازي محصول موردنظر
از ناخالصيهاي ديگر، ميتوان از اين روش استفاده نمود و با اعمال يك برنامة
جداسازي براساس افزايش ميزان نمك و افزايش قدرت
يوني، محصول مورد نظر را براحتي
جداسازي و تخليص نمود.از
اين
روش ميتوان به عنوان مرحلة نهايي يا
مرحله
ای بينابيني
در
كنار روشهاي ديگر كروماتوگرافي عمل جداسازي و تخليص را با هدف رسيدن درجة خلوص
بالا استفاده
کرد.
در مواردي قدرت تفكيك اين روش آنچنان بالاست كه ميتواند به عنوان يك فرايند
تخليص
با
بكارگيري تنها يك روش كروماتوگرافي انجام پذيرد.
آنچه كه در اين حالت حايز
اهميت است
، از ميان پارامترهاي اساسي كروماتوگرافي در اينجا پارامتر درجة خلوص
(Purity)
و ميزان انتخابگري (Selectivity)
اهميت اصلي و اساسي را دارند.
4-3-3-
تقسيمبندي روش
كروماتوگرافي تعويض يوني براساس استراتژي مرحلة جذب
هر روش
كروماتوگرافي به
استثناي
روش
فيلتراسيون
ژلي
(Gel Filtration)
(كه يك تكنيك
كروماتوگرافي ايزوكراتيك
(Isocratic)
بوده و بر اساس
پديدههاي نفوذ و پارامترهاي انتقال جرم انجام ميگيرد) داراي مراحل اساسي تعادلسازي، اعمال نمونه يا مرحلة جذب و مرحلة
جداسازي ميباشد. در مرحلة جذب هدف جذب نمونة موردنظر به رزين كروماتوگرافي
(باتوجه به ليگاند
ويژه آن)
است.
در مرحلة جداسازي سعي ميشود كه نمونه موردنظر جداي از ناخالصيهاي ديگر از
رزين يا ليگاند ويژه جدا شود. با اين مقدمه ميتوان روش كروماتوگرافي تعويض
يوني را برحسب جذب يا عدم جذب پروتئين موردنظر به رزين كروماتوگرافي به دو نوع
تقيسم كرد:
4-3-3-1-
كروماتوگرافي مثبت
در اين روش
هدف جذب پروتئين موردنظر به رزين كروماتوگرافي در مرحلة وارد كردن نمونه
است
كه در نهايت پس از شستشوي ناخالصيها، پروتئين مذكور با اعمال يك برنامة
خارجسازي
از طريق
افزايش غلظت نمك يا قدرت يوني تاحد امكان خالصميشود.
4-3-3-2-
كروماتوگرافي
منفي
در اين تكنيك،
شرايط بافر و رزين كروماتوگرافي به نحوي انتخاب ميشود كه پروتئين موردنظر به
رزين (ليگاند) جذب نشده و در همان مرحلة اعمال نمونه و شستشوي اولية ستون
كروماتوگرافي توسط بافر متعادل كننده از ستون كروماتوگرافي خارج گردد. در اين
تكنيك ناخالصيها عمدتا"
به ستون چسبيده و سپس توسط يك مرحلة جداسازي شديد با استفاده از غلظت بالاي نمك
يا قدرت يوني از ستون خارج ميگردند.
به عنوان نمونه ميتوان به فرايندهايي اشاره كرد كه از ستون كروماتوگرافي
بارزين تعويض كننده آنيوني
استفاده شده درحالي كه شرايط بافر بهنحوي است كه پروتئين موردنظر در محلول
داراي بار مثبت بوده و هيچگونه جاذبهاي با ليگاند داراي بار منفي موجود بر روي
رزين ندارد
و از
ستون كروماتوگرافي دفع ميشود. در اين نمونه عمدتا"
اسيدهاي نوكلئيك يا اندوتوكسينها يا ناخالصيهاي ديگري كه در شرايط بافر داراي
بار منفي باشد به رزين كروماتوگرافي جذب شده و سپس از ستون خارج ميشوند.
4-3-4-
نمونههاي عملي از
استفاده از روش كروماتوگرافي تعويض يوني
4-3-4-1-
استفاده از روش Anion Exchange chromatography
رزين
Q-Sepharose fast flow
در مرحلة Polishing
از مراحل سهگانة ذكر شده
مورد استفاده قرار گرفت.در
اين مرحله هدف افزايش درجة خلوص محصول از ميزان 80% در مراحل قبل به بالاي 95%
ميباشد.
نوع پروتئين:
Recombinant p24-gp36 fusion Pr
پيك شماره يك
مقدار
مادة اوليه: 483.6
mg
مقدار
محصول: 250
mg
نوع رزين :Q-
Sepharose fast flow
حجم رزين:
40 ml
دبي:
3 ml/min
كاري
انجام شده در انستيتو پاستور ايران بخش بيوتكنولوژي
4-3-4-2-
استفاده از رزين Cation Exchanger Resin
براي تخليص پروتئين
نو تركيب
IFN
-Human γ
در مرحلة نهايي تخليص.
نوع پروتئين:
IFN
-Human γ
Recambinant
(پيك شماره يك)
مقدار
ماده اوليه: 195
mg
مقدار
محصول:
82 mg
نوع رزين: SP-Tyopreal
حجم رزين:
14 ml
دبي: 7
ml/min
كاري انجام شده در انستيتو
پاستور ايران بخش بيوتكنولوژي
پايان درس 3
|
