درس 4

نسخه قابل چاپ درس 4 

4-4- كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك (HIC)

روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك از خواص سطوح هيدروفوبيك برای جداسازي بيومولكولها و به خصوص پروتئين‌ها, استفاده مي‌كند. در سال 1348 تيسيليوس (Tiselius) اين روش را در يك مقاله تحت عنوان جداسازي جذبي  بر  اساس    روشSalting – out   براي اولين بار  معرفي  كرد.   گرچه استفاده  از اين روش  تا سالهاي  دهة   70  چندان  مرسوم  نبود  و به ندرت به كار گرفته شد، اما از اين تاريخ به بعد ساخت  رزين‌هاي متنوع  هيدروفوبيك   امكان  استفاده از اين  روش را در  سطح  بسيار وسيعي  فراهم ساخت به‌طوريکه امروزه اين روش بصورت رايج در مورد تخليص بسياري از پروتئين‌ها به كار گرفته مي‌شود.

جهت بررسي روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك در اين قسمت، ابتدا به معرفي مكانيزم جداسازي در اين روش و پارامترهاي موثر و اساسي كه بر فرايند جداسازي در اين روش تأثير مي‌گذارند, مي‌پردازيم.  سپس ويژگي‌هاي فرايند، عملكرد  و  جايگاه آن در كل "فرايند عمليات پايين دستي" را مورد بررسي قرار مي‌دهيم. در پايان نمونه‌هاي عملي از كاربرد اين روش در جداسازي پروتئين‌ را با استفاده از رزين‌هاي هيدروفوبيك معرفي خواهيم كرد.

4-4-1- مكانيزم جداسازي در روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك و پارامترهاي مؤثر بر آن

تمام پروتئين‌ها در ساختار خود داراي سطوح هيدروكربني هستند كه مي‌توانند با سطوح يا عوامل مشابه جاذبه هاي هيدروفوبيك ايجاد نمايند. ‌ لذا  در شرايط محيطي كه پروتئينها بتوانند اين سطوح را بصورت قابل دسترسي قرار دهند، مي‌توانند به عواملي كه داراي ساختار هيدرو كربني و در نتيجه داراي خاصيت هيدروفوبيك ‌باشند, جذب شوند و پيوندهاي غيرقطبي برقرار نمايند. 

سطوح هيدروفوب در محيط آبي بافر به سمت داخل پروتئين متمايل مي شوند, زيرا مولكولهاي آب كه در كنار گروه هاي هيدروفيل موجود در سطح پروتئين قرار دارند به ‌نحوي پروتئين را در بر مي‌گيرند كه سطوح هيدروفوب نمي‌تواند خود را در سطح مولكول عرضه نمايند.

 بنابر اين  همانطوريكه  در  فصل پيش‌پالايش توضيح داده  شد با استفاده  از خاصيت  Salting – out با افزايش مقدار محدود  از نمكهايي  نظير  آمونيوم سولفات  مي‌توان مولكولهاي آب را از اطراف پروتئين كنار زده و سطوح هيدروفوب را در معرض دسترسي عواملي  با ساختار مشابه قرار داد.  اين مسئله اساس آماده‌سازي نمونة پروتئيني جهت استفاده از روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  است و از طرف ديگر رزين  كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  داراي ليگاندهايي است كه ساختار هيدروكربني در شكل‌هاي مختلف حلقه‌هاي بنزني، گروههاي الكيلي و يا هر دوي اين گروهها را دارد و مي‌تواند با سطوح هيدروفوب قابل دسترسي در سطح پروتئين‌ها جاذبه ايجاد نمايد.

 بديهي است هرچه جاذبة هيدروفوب موجود بين سطوح پروتئيني  و  ليگاند رزين  قوي‌تر  باشد,  قدرت  جذب  بيشتر  بوده و لذا در مرحلة خارج‌سازي (desorption) پروتئين‌هاي داراي  جاذبة  قوي‌تر  ديرتر  از ستون خارج مي‌شوند. مكانيزم مرحلة خارج‌سازي براساس كاهش غلظت نمك موجود در محيط داخل  ستون كروماتوگرافي  و  در نتيجه  كاهش  خاصيت Salting out  فراهم مي‌گردد. بدين ترتيب ملاحظه مي‌شود كه روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  از نظر مكانيزم خارج سازي پروتئين دقيقا" با يك استراتژي عكس روش كروماتوگرافي تعويض يوني عمل مي‌كند. در روش كروماتوگرافي تعويض يوني با افزايش غلظت نمك در محيط داخل ستون كروماتوگرافي, عمل خروج انجام مي‌شد درحالي كه در روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  كاهش  غلظت نمك اساس  مكانيزم خروج را تشكيل مي‌دهد.

 پارامترهايي كه جهت كنترل فرايند جداسازي در اين روش بايد مورد توجه قرار گيرند عبارتند از: غلظت و نوع نمك, گروه عاملي, PH محيط,و دما.

4-4-1-1- غلظت و نوع نمك:

باتوجه به تقسيم‌بندي كاتيونها و آنيونهاي نمكهاي مختلف در رابطه با افزايش قدرت Salting – out بنابراين نمكهاي مختلف با غلظتهاي متفاوت مي‌توانند تأثير متفاوتي را از نظر افزايش ميزان Salting – out و در نتيجه قدرت جاذبة يوني بين سطوح هيدروكربني قابل دستيابي با ليگاند موجود بر روي رزين كروماتوگرافي ايجاد نمايند(رجوع شود به بحث Salting – out فصل 3). نمكهايي نظير سولفات آمونيوم و سولفات سديم بسيار مؤثرتر از نمكهايي نظير NaCl مي‌توانند سطوح هيدروفوب پروتئيني را در سطح پروتئين در معرض گروههاي عاملي قرار دهند.

بديهي است افزايش غلظت نمك نيز باعث افزايش اثر Salting – out خواهد شد. به هرحال غلظت نمك در داخل بافر تعادل سازي و نمونة پروتئيني بايد يكسان باشد تا شرايط يكساني را از نظر محيطي در داخل بستر رزين كروماتوگرافي و محلول محتوي پروتئين ايجاد نمايد.

ضمنا" غلظت نمك بايد بهينه شود زيرا غلظت كم نمك مي‌تواند تأثيرپذيري كمي را از نظر Salting – out ايجاد كرده و از طرف ديگر غلظت زياد نمك ممكن است سبب كاهش قدرت انتخابگري رزين در  جذب  پروتئين مورد نظر از  طريق جذب  ميزان  بيشتري از  ناخالصي‌ها و آلاينده‌ها ، احتمال سخت‌تر شدن عمل خروج و جداسازي پروتئين از رزين كروماتوگرافي در مرحلة خروج (desorption)  ، ايجاد مشكلات زيست محيطي جهت تصفية فاضلاب  و  افزايش هزينة  فرايند  بدليل هزينة  بالاي استفاده  از   نمك  در  فرايندهاي  توليد  خواهد  شد.  معمولا" غلظت 1M  نمك  آمونيوم  سولفات  به عنوان  يك  شرايط بهينه  جهت  روش كروماتوگرافي  با جاذبة هيدروفوبيك   در       آماده‌سازي نمونة پروتئيني و محلول تعادل‌سازي پيشنهاد مي‌گردد

4-4-1-2- گروه عاملي:

رزين‌هاي كروماتوگرافي كه در روش ‌كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  مورد استفاده قرار مي‌گيرند از دو قسمت عمده تشكيل مي‌شوند: ماتريس جامد و گروه عاملي – ماتريس جامد كه عمدتا" ساختار كوپليمري دارند بصورت دانه‌هاي ريز با اندازه‌هايي مختلف ساخته شده‌اند. گروه عاملي بصورت گروه‌هاي آلكيلي (خطي)، حلقه‌هاي بنزني و يا تركيبي از اين دو بر روي پايه جامد رزين تثبيت گرديده است.

 در واقع اين گروه عاملي به عنوان ليگاند نقش اصلي را در جذب سطوح هيدروفوب پروتئيني برعهده دارد. بنابراين قدرت جاذبة هيدروفوبيك به قدرت گروه عاملي در كنار ميزان دسترسي به سطوح هيدروفوبيك بستگي دارد. هنگامي كه گروه عاملي از جنس گروه‌هاي آلكيلي باشد، هرچه تعداد اين گروه‌ها و يا تعداد اتمهاي كربن بيشتر باشد قدرت جاذبه بيشتر خواهد بود. رزين‌هايي نظير
  Butyl – Sepharose Fast Flow و Octyl – Sepharose Fast flow كاربردي‌ترين رزين‌هايي هستند كه در ساختار خود به ترتيب گروههاي عاملي بوتيل (C4) و اكتيل (C8) عنوان ليگانه در اختيار دارند.

رزين‌هايي نظير Phenyl – Sepharose Fast Flow نيز از ديگر رزين‌هاي كروماتوگرافي بوده كه با در اختيار داشتن گروه عاملي فنيل به‌عنوان ليگاند، در روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  به‌صورت متداول و رايج مورد استفاده قرار مي‌گيرند البته مقايسة بين گروه‌هاي عاملي آلكيلي و فنيلي از نظر ميزان ايجاد جاذبه همواره امكان پذير نبوده و در مورد پروتئين‌هاي متفاوت ليگاندهاي مختلفي مي‌توانند به‌عنوان گروه عاملي مناسب عمل كنند. ممكن است دليل اين مسئله، عامل ممانعت فضايي و امكان دستيابي سطوح هيدروفوب پروتئيني به گروه‌هاي عاملي باشد.

4-4-1-3- pH

اثر pH بصورت شخصي قابل ارايه نبوده اما بصورت كلي با افزايش pH ميزان آبگريزي (Hydrophobicty)  پروتئين‌ها كم  مي‌شود كه شايد  بدليل افزايش  تيتراسيون  نمونه  و در نتيجه فعال كردن گروههاي  آبدوست (Hydrophil) باشد.
از  طرف  ديگر  با كاهش pH  ميزان آبگريزي  افزايش مي‌ يابد.

 بنابر اين  پروتئين‌  هايي كه  نمي ‌توانند  در pH  خنثي (نزديك 7) به  ستون  هيدروفوبيك  متصل   شوند با كاهشpH    مي‌توان   آنها را به‌ خوبي  در  پروسة   كروماتوگرافي  با جاذبة  هيدروفوبيك  تخليص كرد. با اين وجود، نتايج كار محققين نشان مي‌دهد كه دامنة pH بين 5.5-8 داراي جاذبة هيدروفوبيك بسيار پائين‌تري نسبت به محدودة PH>8 يا PH<5.5 است.

4-4-1-4- دما:

در مورد دما  هم  برخي  گزارش‌ها  افزايش خاصيت  جاذبة  هيدروفوبيك  را  با  افزايش  دما نشان مي‌دهد،  كه البته با  مسئله  افزايش جاذبه‌هاي  و اندروالسي  در  هنگام  افزايش دما مطابقت دارد.  اما از طرف ديگر برخي نتايج نشان از كاهش جاذبة هيدروفوبيك با افزايش دما دارد. بنابراين در اين مورد هم بايد دماي مطلوب پروسة كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  بهينه گردد.

4-4-2-  ويژگي‌هاي كروماتوگرافي

باتوجه به  اينكه  تمام  پروتئين‌ها در ساختمان  خود  داراي سطوح   هيدروفوبيك   بدليل  وجود گروه‌هاي هيدروكربني و غير قطبي در زنجيرة  آمينواسيدهاي  ساختمان اول  پروتئين  مي‌باشند (40 تا 50% سطوح قابل دسترسي پروتئين غير قطبي است)، بنابراين همگي بصورت بالقوه مي‌توان از خاصيت جاذبة هيدروفوبيك در روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  استفاده كرده و عمل جداسازي را امكان پذير نمود. لذا روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  نيز همانند روش كروماتوگرافي تعويض يوني يك روش فراگير بوده و مختص يك پروتئين به‌عنوان پروتئين با خاصيت هيدروفوب نمي‌باشد.

از  طرف  ديگر روش  كروماتوگرافي  با  جاذبة   هيدروفوبيك  به‌ عنوان يك  روش مكمل  مي‌تواند  در  كنار روشهاي  كروماتوگرافي  تعويض يوني،  فيلتراسيون   ژلي (Gel Filtration) و كروماتوگرافي ميل تركيبي
(Affinity Chromatograophy) مورد استفاده قرار گيرد. از طرف ديگر باتوجه به اينكه اين روش يك روش جذبي است, بنابراين محدوديتي از نظر حجم نمونه براي استفاده از روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  وجود ندارد و روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  قدرت جداسازي بسيار بالايي داشته و  براحتي مي‌توان با استفاده از گراديان خطي كاهش غلظت نمك در بستر كروماتوگرافي، موفقيت خروج پروتئين موردنظر را نسبت به بقية پروتئين‌ها يا ناخالصي‌ها شناخته و سپس با استفاده از يك برنامة شستشوي مرحله به مرحله، عمل جداسازي را به‌خوبي انجام داد. باتوجه به ظرفيت بالاي رزين‌هاي كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  مي‌توان بخوبي مقادير بالاي پروتئيني را با استفاده از اين روش تخليص كرد.

يكي از مهمترين ويژگي‌هاي روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  قابليت كاربرد آن به عنوان اولين روش كروماتوگرافي در "فرايند عمليات پايين دستي" مي باشد.   زيرا معمولا" قدرت رسانايي بيشتر محلولهاي بيولوژيك بالا (در حدود 15-30ms/cm )بوده و بخوبي مي‌توان از روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  به‌عنوان اولين روش استفاده كرده و از عملياتهايي نظير نمك‌زدايي (Deselting) و يا فيلتراسيون (Diafiftration) و ترقيق (Dilution) احتراز كرد. با اين حال روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  لزوما" به‌عنوان اولين روش مورد  استفاده  قرار نگرفته  و  مي‌تواند  بصورت روش مكمل  با روشهايي كه  قبلا” ذكر شد به‌عنوان روش واسطه در پروسة DOP قرار گيرد، به اين ترتيب با استفاده از روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  مي‌توان بسياري از ناخالصي‌ها را حذف كرد.

4-4-3- نمونة عملي استفاده از روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  در "فرايند عمليات پايين دستي"

در تخليص پروتئين نوتركيب استرپتوكيناز (Y-Streptokinase) از روش كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  در مرحلة  نهايي  استفاده  گرديده   تا   اينكه  درجة خلوص  از  مقدار 75% بعد از مرحلة  كروماتوگرافي تعويض يوني به‌ميزان 93% بعد از مرحلة كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  ارتقاء يابد. "فرايند عمليات پايين دستي" طراحي شده براي تخليص پروتئين استرپتوكيناز يك پروسة بسيار موفق بوده كه از دو روش كروماتوگرافي تعويض يوني و كروماتوگرافي با جاذبة هيدروفوبيك  در كنار يكديگر جهت انجام فرايند تخليص استفاده گرديده است.

 نمونة استفاده از رزين Butyl – TSK  جهت تخليص پروتئين استروپكيناز

كاري انجام شده در مركز CIGB هاوانا كوبا

نوع رزين: Butyl – TSK

مقدار رزين: 5 ml

مقدار نمونة پروتئيني قبل از كروماتوگرافي: 18.72 mg

مقدار محصول: 6.24 mg

Flow rate: 2 ml/min

ادامه...

 

فهرست مطالب...

يادداشت برداريد...

تقويم...

بحث در مورد اين درس...

نظرخودرا منعكس كنيد...

نامه الكترونيكي به سايرين...

خروج از كارگاه...

If you have problem to view this page in Farsi please download these fonts: Mitra    Lotus   Titr in your directory of windows\fonts

or adjust Enconig of your explorer (from View menu) to unicode UTF-8