4-5

4-5- كروماتوگرافي ميل تركيبي
(AC) (Affinity Chromatography)

بيش از سي سال است كه استفاده از روش كروماتوگرافي ميل تركيبي به صورت وسيع مرسوم شده است. اين روش نقشي منحصر بفرد را در تكنولوژي جداسازي بيومولکول ها ايفا كرده است، زيرا تنها روشي است كه عمليات جداسازي را براساس نقش بيولوژيك مولكول يا ساختار شيميايي خاص هر ذره امكان پذير مي‌سازد.

در سال 1910 روش كروماتوگرافي ميل تركيبي براي جذب آميلاز (Amylase) به استارچ (Starch) غيرمحلول مورد استفاده قرار گرفت، اما به دليل وجود مشكلات جدي در انتخاب رزين و ليگاند مناسب, با استقبال چنداني مواجه نشد. در سالهاي بعد تكنولوژي ساخت رزين عملا" اين امكان را فراهم آورد كه از رزين‌هاي كروماتوگرافي و ليگاندهاي متنوعي كه براساس ميل تركيبي عمل كرده و مي‌توانند به صورت ويژه جهت جذب طيف وسيعي از بيومولکول هاي بكار روند، استفاده كرد.

در اين بخش بعد از شناخت اساس روش كروماتوگرافي ميل‌تركيبي به معرفي عوامل مؤثر و مهم در فرايند جداسازي در اين روش مي‌پردازيم. در عين حال، ليگاندهاي متفاوتي كه در روش كروماتوگرافي ميل‌تركيبي براي جذب بيومولکول ‌هاي خاص مورد استفاده قرار مي‌گيرند را معرفي مي‌كنيم. همچنين ويژگي‌هاي اين روش را از نظر پارامترهاي اساسي فرايند و نيز نقش اين روش در "فرايند عمليات پايين دستي"را مورد بررسي قرار مي‌دهيم. در انتها، نمونه‌هاي عملي از كاربرد اين روش را در جداسازي پروتئين‌ها ذكر مي‌نماييم.

كروماتوگرافي ميل‌تركيبي يك روش جذبي است كه در آن يك ليگاند خاص كه جاذبة بيولوژيك اختصاصي با يك بيومولکول يا يك دسته از بيومولکول ها دارد، از يك طرف بر روي يك پاية جامد (ماتريس) تثبيت شده و از طرف ديگر بيومولکول موردنظر را جذب مي‌كند (شكل 4ـ4).

الف)‌مرحلة تثبيت ليگاند بر روي پاية جامد رزين

ب) مرحلة جذب بيومولکول و ايجاد پيوند كووالان با ليگاند

همانطوريكه در شكل مشخص شده است اساس روش بر پايه يك واكنش برگشت‌پذير كه به صورت پيوند كووالان بين ليگاند و بيومولکول موردنظر صورت مي‌گيرد,استوار است. بنابراين پس از انتخاب يك ليگاند مناسب كه توانايي ايجاد پيوند كووالان اختصاصي با بيومولکول موردنظر را داشته باشد، بايد ابتدا ليگاند مذكور را بر روي يك پاية جامد تثبيت نموده, سپس شرايط جذب بيومولکول اختصاصي را به ليگاند موردنظر فراهم كرده و در پايان عمل جداسازي ليگاند از بيومولکول موردنظر را با استراتژي‌هاي مناسب انجام داد.

تركيبات متفاوتي به‌عنوان ليگاند در روش کروماتوگرافي ميل جذبي قابل استفاده هستند كه هركدام توانايي ايجاد جاذبه بيولوژيك با تركيبات خاصي را داشته و به‌خوبي مي‌توانند در جداسازي اين تركيبات بكار روند(جدول 4-1).

جدول 4ـ1ـ برخي از تركيبات که مي‌توانند به‌عنوان ليگاند براي تخليص مورد استفاده قرار گيرند

تركيبات مربوطه	ليگاند
تركيبات مشابه، ممانعت كننده‌ها، كوفاكتورها	آنزيم
آنتي‌ژن، ويروس، سلول	آنتي‌بادي
پلي ساكارايد، گليكوپروتئين، گيرنده‌هاي سطح سلولي، سلول	لكتين (Lectin)
هيستون‌ها، اسيدهاي نوكلئيك، پليمرازها، پروتئين‌هاي متصل شونده	اسيدهاي نوكلئيك
دريافت كننده‌ها، پروتئين هاي حامل	هورمون‌ها و ويتامين‌ها
پروتئين‌هاي ويژه سلولي، لكتين	سلول‌ها
پروتئين‌هاي داراي هيستيدن و سيستين	يونهاي فلزي يا بار مثبت مانند Ni²⁺، Zn²⁺, Ca²⁺

به هرحال، روش کروماتوگرافي ميل جذبي باتوجه به استفاده از يك جاذبة بيولوژيك مي‌تواند بدون محدوديت در حجم نمونه، به خوبي عمليات كروماتوگرافي را انجام دهد و تنها بايد مقدار بيومولکول، و اختصاصا" پروتئين موردنظر در داخل نمونة ، متناسب با ظرفيت رزين كروماتوگرافي باشد تا از اِعمال بيش از اندازة نمونة موردنظر (Over loading) احتراز گردد. به همين دليل، اين روش در مواقعي كه حجم نمونة اوليه زياد باشد يا نياز به رقيق كردن نمونة اوليه احساس گردد، مي‌تواند به خوبي مورد استفاده قرار گيرد و همانند روشهايي نظير IEC يا HIC يك روش مناسب براي تغليظ نمونة موردنظر به شمار مي‌آيد. به علاوه روش کروماتوگرافي ميل جذبي داراي اين مزيت ويژه است كه به دليل استفاده از جاذبة بيولوژيك كه معمولا" بسيار قوي مي‌باشد، داراي قدرت انتخابگري (Selectivity) و ميزان بازيابي (Recovery) بسيار بالايي است. در عين حال اين روش تا اندازه‌اي قدرت تفكيك و درجة خلوص را بالا مي‌برد كه مي‌توان در دو مرحله از تركيبي از آن و سپس فيلتراسيون ژلي استفاده كرد و پروتئين موردنظر را تخليص نمود. شايد مهمترين ضعف روش کروماتوگرافي ميل جذبي امكان خروج ليگاند در مرحلة دفع همراه با پروتئين مورد نظر باشد كه مي‌تواند سبب ايجاد واكنشهاي جانبي و مشكلات جدي گردد كه حتما" بايد در مراحل بعد آشكار و حذف شود.

حال برخي از پارامترهايي كه قويا" در كنترل عمل تخليص توسط روش كروماتوگرافي ميل تركيبي تأثير مي‌گذارند مورد بررسي قرار مي‌دهيم.

در روش کروماتوگرافي ميل جذبي ابتدا بايد ليگاند موردنظر بر روي يك پايه جامد (ماتريس) كه داراي ساختار پليمري و به صورت دانه هاي ريز ( با طيفي از اندازه هاي متفاوت) است، تثبيت گردد. خصوصيات اين ماتريس بسيار مهم است و انتخاب ماتريس مناسب مي‌تواند در افزايش قدرت تثبيت ليگاند بر روي پاية جامد از طريق ايجاد اتصال كووالان با گروه هاي موثر موجود بر روي ماتريس كمك نمايد. البته بايد توجه نمود كه اين اتصال بايد برگشت پذير بوده و بعدا" بتوان ليگاند را از ماتريس توسط روش مناسب جدا كرده و در صورت نياز از ماتريس براي اتصال ليگاند ديگري استفاده نمود. از طرف ديگر بايد اندازة تخلخلهاي موجود بر روي دانه‌هاي رزين (شبكة جامد) به نحوي باشد كه ليگاندهاي تثبيت شده را به ‌نحو موثري در دسترس پروتئين يا بيومولکول قرار دهد. بنابراين ساختار يك ماتريس مناسب و اندازة تخلخلها مي‌تواند به‌خوبي در افزايش ميزان اتصال ليگاند و همچنين افزايش ظرفيت جذب بيومولکول كمك نمايد. رزين‌هايي نظير Sepharose 4B به‌نحو چشمگيري داراي اين خاصيت هستند كه علاوه بر افزايش قدرت اتصال ليگاند و ظرفيت جذب، كمترين جاذبة غير اختصاصي را با بيومولکول دارند. به علاوه رزين‌هاي داراي پايه Sepharose در شرايط عملكردي, از نظر دبي جريان و pH، بسيار پايدار هستند. بطور كلي بايد در انتخاب رزين مناسب در شرايط عملكردي سخت از نظر pH، دما، وجود تركيباتي نظير دترجنت‌ها و تركيبات آلي، و استفاده از مواد کائوتروپيک مانند گوانيدين هيدروكلرايد دقت نمود.

يك ليگاند مناسب براي استفاده در يك روش کروماتوگرافي ميل جذبي بايد داراي دو خصوصيت مهم باشد: اولا" داراي جذب اختصاصي و درعين حال برگشت پذير با بيومولکول مورد نظر باشد. ثانيا" گروههاي عاملي ليگاند بايد به‌نحوي باشند که ليگاند درعين موفقيت در عمل تثبيت بر روي پاية پليمري، فعاليت بيولوژيك ويژة خود را از دست ندهد.

معمولا” براي بررسي خاصيت جذب مواد يك ثابت تفكيك تعريف مي‌كنند كه همان ثابت واكنش پيوند دو ماده در شرايط برگشت پذير است. و برحسب واحد غلظت بيان مي‌شود. در مورد ليگاندهاي مورد استفاده در روش كروماتوگرافي ميل تركيبي نيز ثابت تفكيك بايد در دامنه M 10^-8_10^-4باشد. درصورتي كه ثابت تفكيك از M 10^-4بزرگتر باشد، قدرت پيوند کووالان بين ليگاند (L) و بيومولکول موردنظر (S) آنقدر زياد خواهد بود كه بعد از خارج كردن ناخالصي‌ها از ستون كروماتوگرافي، جداكردن بيومولکول در مرحلة دفع (desorption) از ليگاند و بسيار مشكل بوده و شرايط خارج‌سازي بسيار سخت خواهد بود. در صورتي كه ثابت تفكيك ليگاند و بيومولکول از M 10^-8كمتر باشد قدرت جاذبة اختصاصي آنچنان بالا نبوده و درنتيجه خاصيت انتخابگري و قدرت تفكيك ستون کروماتوگرافي در روش كروماتوگرافي ميل تركيبي پايين‌ خواهد آمد. به طور كلي اگر هيچ نوع اطلاعاتي از نظر قدرت جذب ليگاند بيومولکول موجود نباشد معمولا" يك روش سعي و خطا براي انتخاب ليگاند مناسب پيشنهاد مي‌گردد.

از طرف ديگر، در توضيح خاصيت دوم ليگاند،‌ بايد گفت كه ساختار رزين بايد به نحوي باشد كه درصورت وجود چندين گروه عاملي در ساختار ليگاند، اتصال و تثبيت ليگاند بر روي پاية جامد به‌نحوي انجام گردد كه حتي‌الامكان گروه‌هاي مؤثر در جاذبة بيولوژيك ليگاند – بيومولکول درگير نشده و بتوانند عمل جاذبة اختصاصي را به‌خوبي انجام دهند.

باتوجه به مسئلة ممانعت قضايي و امكان عدم دستيابي ليگاند موردنظر به گروههاي موردنياز جهت تثبيت بر روي شكبة پليمري و نيز تأثير عامل ممانعت فضايي در دستيابي مناسب بيومولکول به ليگاندهاي تثبيت شده، وجود بازوهاي اتصال (Spacer arm) برروي ماتريس جامد پيشنهاد شده است. بدين‌ترتيب ليگاند موردنظر برروي اتصال قرار گرفته مي‌تواند تأثير عامل ممانعت فضايي را كاهش دهد. اين مسئله بخصوص در مورد استفاده از ليگاندهايي با اندازة كوچك (نظير كوفاكتورها در تخليص آنزيم‌ها) داراي اهميت فراوان است.

استفاده از يك بازوي اتصال، تثبيت ليگاند بر روي ماتريس جامد كه از نوع Sepharose مي‌باشد را تسهيل كرده و از طرف ديگر اتصال بيومولکول با ليگاند تثبيت شده نيز راحت‌تر انجام مي‌گيرد. بايد توجه داشت كه طول بازوي اتصال كه از جنس زنجيره‌هاي آلي است بايد بهينه باشد. درصورتي كه طول بازوي اتصال كوتاه باشد، بازوي اتصال عملا” كارآيي خود را از دست خواهد داد. در حالت عكس اگر بازوي اتصال بيش از حد بلند باشد باتوجه به اينكه جنس آن از زنجيره‌هاي آلي است، مي‌تواند با بيومولکول هايي كه بصورت طبيعي داراي گروههاي آلي و هيدروكربني در ساختار خود هستند،جاذبة هيدروفوبيك ايجاد نمايد و بازدهي كل سيستم را پايين خواهد آورد.

4-5-1-4- تثبيت ليگاند بر روي ماتريس جامد و فعال سازي رزين:

باتوجه به اهميت ليگاند در يك روش جذبي بديهي است كه انتخاب رزين مناسب و شرايط فعال‌سازي و تثبيت ليگاند برروي ماتريس جامد از اهميت فوق‌العاده‌اي برخوردار است لذا در انتخاب پروتكل مناسب عمل تثبيت ليگاند در كنار شرايط ويژه‌ رزين كروماتوگرافي ، پايداري فيزيكي و شيميايي و وجود يا عدم وجود بازوي اتصال نيز برروند عمليات كروماتوگرافي ميل جذبي تأثير مي‌گذارد. بديهي است هر شركت سازندة رزين كروماتوگرافي ويژگي‌هاي رزين توليد شده را نيز ارايه مي‌دهد و جهت آگاهي از پروتكل‌هاي فعال‌سازي اين رزين‌ها و خواص رزين‌ مي‌توان به اين پروتكل‌ها مراجعه كرد. در اينجا برخي از رزين‌هاي مشتق شده از Sepharose كه توسط شركت Pharmacia , LKB توليد شده است، معرفي شده و خواص مربوط به آنها به اختصار آمده است كه جهت مطالعة بيشتر مي‌توان به كاتالوگ‌ها و بروشورهاي اين كمپاني كه در اينجا به‌عنوان منبع نيز ذكر شده‌اند مراجعه كرد.

ـ رزين: CNBr – activated sepharose 4B و اين رزين كه با سيانوژن برمايد (CNBr) فعال شده است توانايي تثبيت ليگاندهايي كه داراي گروهها آميني نوع اول مي‌باشند به راحتي با سرعت و با ايمني بالا بوسيلة يك واكنش لحظه‌اي و سريع تثبيت شوند.

ـ رزين Tresyl – activated sepharose 4B كه با ترسيل (Tresyl) فعال شده‌اند توانايي تثبيت و پيوند لحظه‌اي ليگاند را از طريق گروههاي آميني ياتيول را دارند.

ـ CH Sepharose 4B , AH Sepharose 4B كه هر دو داراي يك بازوي اتصال با 6 اتم كربن بوده و عمل تثبيت ليگاند را از طريق گروههاي به‌ترتيب كربوكسيل و آميني فراهم مي‌نمايند.

ـ Activated CH Sepharose 4B كه داراي يك بازوي اتصال 6 كربني بوده و با در اختيار داشتن يك استر (ester) فعال قابليت تثبيت آني از طريق گروههاي آميني را دارد.

ـ Activated Thial Sepharose 4B كه با در اختيار داشتن يك بازوي اتصال بصورت يك گلوتاتيون عمل تثبيت بازگشت پذير پروتئين‌ها را از طريق گروههاي تيول آزاد فراهم مي‌نمايد.

ليگاندهاي قابل استفاده در اين روش طيف وسيعي را در بر مي‌گيرند و براي تخليص هر بيومولکول (در اينجا پروتئين) مي‌توان باتوجه به ساختار بيومولکول موردنظر يك ليگاند مناسب را انتخاب كرد. به هرحال ليگاندهاي مورد استفاده در روش کروماتوگرافي ميل جذبي به دو دسته كلي تقسيم مي‌شوند: ليگاندهاي داراي جاذبة اختصاصي به يك نوع پروتئين خاص (Mono specific adsorbent) و ليگاندهاي داراي جاذبة اختصاصي به يك گروه از پروتئين‌ها (group specific adsorbent). در مورد دستة اول، ليگاند موردنظر فقط جاذبة اختصاصي به يك پروتئين خاص داشته و نمي‌تواند براي پروتئين ديگري مورد استفاده قرار گيرد. مثلا” استفاده از آنتي‌بادي مونوكلونال جهت تخليص يك آنتي‌ژن خاص در تخليص پروتئينها مرسوم است و داراي قدرت تخليص و انتخابگري بسيار بالايي مي‌باشد. در اين مورد ذكر اين نكته مهم است كه درصورتي كه تهيه ليگاند موردنياز امكانپذير بوده و بتوان از منابع موجود آن را بدست آورد اين روش بسيار مؤثر بوده و مي‌توان با يك مرحلة كروماتوگرافي درجة خلوص را به‌نحو بسيار چشمگير افزايش دهد. اما معمولا” تهية يك چنين ليگاندهايي خود داراي پروسه‌هاي پرهزينه بوده و كار بسيار مشكلي است.در دستة دوم، ليگاند مي‌تواند جهت تخليص چندين نوع پروتئين مختلف مورد استفاده قرار گيرد و جاذبة ويژة بين ليگاند و پروتئين در بين چندين نوع پروتئين مختلف مشترك است. به‌عنوان مثال هپارين (Heparin) به‌عنوان ليگاند مي‌تواند جهت تخليص طيف وسيعي از پروتئينها از جمله عوامل رشد (growth factors)، عوامل سنتز پروتئين (Protein Synthesis Factors)، پروتئينهاي لخته‌سازي (Coagulation Proteins) و غيره مورد استفاده قرار ‌گيرد.

جدول 4ـ2ـ برخي از رزينهاي كروماتوگرافي با جاذبة اختصاصي گروهي (Group specific adsorbents) كه توسط شركت Pharmacia توليد شده اند.

نوع رزين	ويژگي
Protein A Sepharose CL-4B	ناحيه Fc ايمونوگلوبولين(IgG) و مولكولهاي مربوطه
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	ناحيه Fc ايمونوگلوبولين(IgG)
Heparin Sepharose CL6B	طيف وسيعي از پروتئينها; عوامل رشد, عوامل سنتز پروتئيني , پروتئيهاي لخته ساز و غيره
Con A Sepharose	Terminal Alpha-D-glucopyranosyl , Alpha -D-mannopyranosyl
Wheat germ Lectin Sepharose 6MB	N-Acetyl-Glucoseamin
Lysine Sepharose 4B	Plasminogen ; Ribosomal RNA

4-5-2-شرايط عملياتي و نكات مهم در مراحل انجام كروماتوگرافي ميل جذبي براي خالص‌سازي پروتئين‌ها

روش کروماتوگرافي ميل جذبي نيز همانند تمام روشهاي ديگر جذبي داراي مراحل عملياتي تعادل‌سازي، اعمال نمونة (مرحلة جذب نمونه)، شستشوي ناخالصيها پيش از خارج سازي پروتئين مورد نظر و نهايتا مرحله دفع يا خارج سازي پروتئين مورد نظر از ستون كروماتوگرافي ميل جذبي است. االبته اين مراحل در كنار مراحلي تكميلي نظير بازيابي ستون كروماتوگرافي (Regeneration)، تميز كردن در محل (Cleaning – in – Place)و نگهداري (Storage) است كه بصورت معمول و پياپي بعد از هر مرحله (يا چند مرحلة كروماتوگرافي بسته به نوع رزين، طول عمل رزين و پايداري آن) در مورد تمام ستون‌هاي كروماتوگرافي انجام مي‌پذيرد. اما قبل از پرداختن به مراحل اساسي فوق در پيشبرد روش کروماتوگرافي ميل جذبي بازهم لازم به تأكيد است كه در اين روش به‌خصوص ممكن است كه ليگاند مورد نظر از قبل بر روي رزين كروماتوگرافي تثبيت نشده باشد و نياز به تثبيت آن باشد كه يك مرحلة اساسي و حساس در انجام کروماتوگرافي ميل جذبيبوده و قبلا” در مورد آن بحث شده است.

انتخاب ستون كروماتوگرافي (از نظر جنس خود ستون، حجم و شكل آن) به حجم از نظر مقدار پروتئين تحت انجام پروسة ، ظرفيت رزين، و مقياس و ظرفيت توليد وابسته است. شركت Phamacea ستونهايي را مخصوصا” جهت انجام روش AC توليد و پيشنهاد كرده است كه عبارتند از: K16120, K15130, K9130, K9115 (عدد اول نشاندهندة قطر ستون برحسب واحد ميليمتر و عدد دوم نشاندهندة ارتفاع ستون است.)

در مورد شرايط عملياتي نيز بايد گفت كه پارامتري نظير دبي (Flow rate) در اين روش باتوجه به پايداري و قدرت تفكيك رزين موردنظر انتخاب مي‌گردد. معمولا” در مراحل تعادل‌سازي، جذب يا اعمال نمونه و شستشوي اولية ناخالصي‌ها با استفاده از بافر تعادل‌سازي، مي‌توان از حد نهايي دبي پيشنهاد شده براي كاهش زمان انجام فرايند استفاده كرد. البته بايد فشار مقاوم را در اين مرحله مدنظر قرار داد چرا كه افزايش آن مي تواند سبب افزايش هزينة عملياتي گردد. اما در مرحلة دفع يا خارج‌سازي بايد از حداقل دبي ممكن استفاده كرد، به‌خصوص در مواقعي كه مواد متفاوتي در مرحلة خروج از رزين خارج مي‌گردند. بدين ترتيب مي‌توان قدرت تفكيك و بازيابي پروتئين موردنظر را بالابرد.

در مورد اعمال نمونه حتما” بايد ظرفيت رزين كروماتوگرافي را در نظر داشته و مقدار پروتئين قابل اعمال بايد در اندازة اين ظرفيت باتوجه به حجم رزين انتخاب شده باشد. بديهي است استفاده از مقدار كم نمونه جهت يك مقدار مشخص از رزين سبب ترقيق بيش از حد نمونة پروتئيني، عدم رديابي دقيق خروج پروتئين و در نتيجه كاهش بازيابي (Recovery) پروسه خواهد شد. همچنين استفاده از نمونه بيش از حد ظرفيت رزين كروماتوگرافي سبب اعمال بيش از حد نمونه به ستون كروماتوگرافي و عدم تخليص بخشي از نمونة پروتئيني خواهد شد. همچنين شرايط نمونه از نظر pH، قدرت يوني و دما بايد با بافر تعادل‌سازي يكسان بوده و درصورت نياز نمونه را با بافر تعادل‌سازي رقيق نمود. رقيق شدن نمونه تأثيري بر روند تخليص و قدرت تفكيك ندارد و ستون کروماتوگرافي ميل جذبي به‌خوبي مي‌تواند آن را تغليظ نمايد.

اما در مورد خارج‌سازي پروتئين در مرحلة دفع بايد دقت بسيار زيادي را بعمل آورد زيرا بخش مهمي از موفقيت عمل تخليص به اين مرحله بستگي دارد. باتوجه به اينكه تركيب يا کمپلکس ايجاد شده بين پروتئين و ليگاند در ستون کروماتوگرافي ميل جذبي داراي پيوندهايي از نوع جاذبه‌هاي الكترواستاتيك، اثرهاي هيدروفوب و پيوندهاي هيدروژني است، لذا هر عاملي كه باعث تضعيف اين پيوندها شود مي‌تواند سبب خروج پروتئين از ستون كروماتوگرافي گردد. استفاده از ترکيبي در بافر خارج‌سازي كه داراي ساختار مشابه با پروتئين يا قسمت فعال پروتئين برای ايجاد پيوند با ليگاند تثبيت شده باشد،‌نيز باعث کاهش جاذبه‌هاي فوق‌الذكر گرديده و در واقع با ايجاد يك مكانيزم رقابتي بين جزء مذكور و پروتئين موردنظر با افزايش غلظت جزء افزوده شده در بافر خروج، عملا” امكان دستيابي اين جزء را به ليگاند بيشتر و در ميدان رقابت با پروتئين مورد نظر باعث خروج پروتئين موردنظر از رزين خواهد شد. از طرف ديگر، تغيير شرايط بافر خروج نسبت به بافر تعادل‌سازي از نظر pH و قدرت يوني بافر از روشهاي مرسوم ديگر در مرحلة خارج‌سازي پروتئين از ستون AC مي‌باشد. تغيير pH بافر معمولا” بصورت كاهش pH مي‌باشد كه باعث تغيير درجة يونيزاسيون گروههاي باردار شده در سايتهاي پيوندي مي‌شود و سبب خروج پروتئين موردنظر مي‌گردد. بهرحال، در انتخاب دامنة تغيير pH همواره بايد مسئله پايداري پروتئين موردنظر را در شرايط خروج از ستون كروماتوگرافي در نظر گرفت.

تغيير قدرت يوني بافر و ايجاد يك گراديان خطي كه در آن غلظت نمك موجود از بافر تعادل‌سازي به بافر خارج‌سازي افزايش مي‌يابد نيز سبب خروج پروتئين موردنظر از ستون به دليل تغيير پيوندهاي الكترواستاتيك ايجاد شده بين پروتئين و ليگاند مي‌شود. معمولا” وجود نمك NaCl در غلظت 1 مولار مي‌تواند به راحتي سبب خروج بسياري از پروتئين‌ها مخصوصا” آنزيم‌ها از ستون کروماتوگرافي ميل جذبيگردد.

بهرحال در مواردي استفاده از موادي نظير دي‌اكسان (Dioxane) يا اتيلن گليكول (Etlylene glycol) نيز مي‌تواند سبب خروج بيومولکول موردنظر از ستون AC گردد كه ممكن است سبب غيرفعال شدن مادة خارج شده گرديده و زياد پيشنهاد نمي‌گردد. همچنين در صورتي كه استفاده از تمام شرايط فوق در خارج‌سازي پروتئين موردنظر موفق نباشد مي‌توان از بافرهاي داراي عوامل كايوتروپيك (اوره و گوانيدين هيدروكلرايد) براي خارج‌ساختن پروتئين موردنظر از طريق تغيير ساختار پروتئين استفاده كرد. بايد در نظر داشت كه مرحلة دفع يا خروج مي‌تواند بصورت يك گراديان خطي با استفاده از يك برنامة مرحله‌اي با استفاده از بافرهايي با شرايط متفاوت و براساس هركدام از شرايط فوق مي‌تواند جهت خروج و جداسازي پروتئين موردنظر از ناخالصي‌هاي ديگر مورد استفاده قرار گيرد.

4ـ3ـ3ـ كروماتوگرافي با استفاده از يون فلزي تثبيت شده (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography) (IMAC)

استفاده از روش IMAC به‌عنوان يكي از انواع روشهاي AC که در آن از يك ليگاند خاص فلزي استفاده مي‌گردد بسيار مرسوم است و به خاطر مكانيزم خاص اين روش، امروزه مهندسي ژنتيك استفاده از روش IMAC را براي تخليص طيف وسيعي از پروتئينها عملي ساخته و لازم است كه مورد بررسي ويژه قرار گيرد.

مكانيزم استفاده از روش IMAC برپاية استفاده از يك ليگاند بصورت يونهاي فلزي مثبت نظير ZN²⁺, Ca²⁺, Ni²⁺و غيره مي‌باشد كه جاذبة اختصاصي‌اي به گروههاي آمينواسيد هيستيدين و سيستين (مخصوصا” گروه هيستيدين) دارند و در صورتي كه پروتئين داراي چنين گروههايي در ساختار خود باشد مي‌توان از اين تكنيك استفاده كرده و پروتئين موردنظر را تخليص نمود. هرچه تعداد گروههاي آمينو اسيدي فوق‌الذكر در ساختار پروتئين بيشتر باشد قدرت جذب بيشتر خواهد بود. اما بهرحال بسياري از پروتئينها اصلا” يا به تعداد كافي (بيش از 2 يا 3 گروه هيستيدين ) در ساختار خود نيستند، لذا تكنيكهاي مهندسي ژنتيك اين امكان را فراهم ساخته اندكه به توان با ايجاد يك پروتئين فيوژن يا تركيبي از پروتئين موردنظر در كنار دنباله‌اي از آمينواسيدهاي هيستيدين نسبت به تخليص چنين پروتئينهايي نيز از طريق روش IMAC استفاده كرد. نهايتا” پس از پايان عمليات درصورت نياز مي‌توان دنبالة آمينواسيدي را از پروتئين موردنظر جداكرد.

همانطوريكه قبلا” گفته شد روش IMAC اساسا” يك روش کروماتوگرافي ميل جذبي بوده و دقيقا” ويژگي‌ها و الزامات روش AC را كه قبلا” ذكر شد دارد. جهت درك بهتر فرايند جذب پروتئين به رزين مورد استفاده در روش IMAC شكل (4ـ6) بصورت شماتيك اتصال يك پروتئين با يون فلزي تثبيت شده بر روي پاية جامد پليمري رزين را نشان مي‌دهد.

شكل 4ـ6ـ نحوة اتصال پروتئين به ليگاند در روش IMAC

در مرحلة خروج يا دفع پروتئين از ستون IMAC، علاوه بر روشهايي نظير تغيير pH يا افزودن نمك ، عمليات خارج‌سازي پروتئين از طريق يك مكانيزم رقابتي بسيار مرسوم است. همانطوريكه شكل 4ـ7ـ نشان مي‌دهد ساختمان ايميدازول بسيار شبيه ساختار گروه هيستيدين است كه نقش اساسي را در اتصال پروتئين به ليگاند فلزي در روش IMAC دارد. لذا اعمال يك گراديان خطي از طريق افزايش غلظت ايميدازول در بافر خارج‌سازي براحتي مي‌تواند سبب افزايش رقابت بين ايميدازول و هيتيدين جهت اتصال به ليگاند فلزي شده و خروج پروتئين را تسهيل نمايد.

به هرحال همانطوريكه در مورد كل روش کروماتوگرافي ميل جذبي گفته شد، بازيابي (Regeneration) رزين مورد استفاده در روش IMAC نيز بسيار حايز اهميت بوده و حتما” بايد پروسة تثبيت يون فلزي و شستشوي رزين IMAC را طبق پروتكلي كه شركت سازندة رزين توصيه مي‌كند انجام داد.

4-5-4- نمونه‌هاي عملي استفاده از روش کروماتوگرافي ميل جذبي در تخليص پروتئينها

روش IMAC براحتي مي‌توان در تخليص پروتئينهاي فيوژن كه داراي دنبالة 6x – His هستند، بكار رود. شكل (4ـ8) تصوير SDS – PAGE از نتايج آناليز روش IMAC جهت تخليص پروتئين‌هاي فيوژن ويروس HIV را نشان مي‌دهد.

شكل 4ـ8ـ نتيجة SDS – Page جهت بررسي روند تخليص پروتئين فيوژن P24 – gp41 كه داراي دنبالة 6x – His بوده و از روش IMAC جهت تخليص آن استفاده مي‌شود

شماره 3: (مرحله بعد) نمونه تخليص شده توسط ستون GF

شماره 4: (مرحله بعد) نمونه تخليص شده نهائي توسط ستون IEC